实时荧光基因相对表达数据处理△△CT.doc

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）数据处理相对定量CT 和2-CT方法一、实时荧光原理及其中的概念实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）作为分子生物学实验中强大快速的一种检测手段，已经被广泛应用于临床和普通实验室。废话不多说，简单介绍一下其原理，和两个基本概念Ct（Cycle threshold）和扩增效率，然后详细解释一下相对基因定量的方法。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析。qPCR中常用的荧光染料为SYBR Green I ，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，因此在PCR每个循环的延伸(双链 图2)过程中检测荧光信号，可以绘制原始的扩增曲线。如下图1：图2 ：双链发射荧光图1：PCR扩增曲线Rn荧光信号量，n为循环数 n 扩增曲线可以分为：图31. 基线期 ：-荧光信号在最初的数个循环里变化不大，接近一条直线，称为基线。2. 对数期 ：-继基线之后，扩增进入到指数增长期，像细菌的繁殖曲线3. 平台期 ：-随着扩增的循环增加,引物,dNTP的消耗殆尽,不会再有新的DNA链产生了,就进入到平台期了图3 扩增曲线的分期实时荧光PCR中重要的概念：CT 、扩增效率CT值（Cycle threshold value）：实时荧光PCR过程中，扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环数。起始模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。扩增效率E（efficiency）：理想的PCR反应在指数期应该是Rn=R0 * 2n（Rn，n次循环产物量。R0，初始模板量。n，循环次数） 因为每扩增一次PCR产物就会变为上次的2倍。但是在实际PCR扩增中E基本在0.65-0.9。因此每个PCR反应的效率不一定都相同。因此，扩增公式可以写成 ：Rn= R0*（1+E）n二、2-CT数据处理的方法基因定量包括绝对定量和相对定量。绝对定量就是标准曲线法，这里不详细介绍，可以问度娘。绝对定量法比较费时费力，除了特殊情况，相对定量的方法也可以达到实验目的。在相对基因定量方法中，目前被广泛采用的就是2-CT法。用此方法有个前提，即目的基因（interest gene）和内参基因（endogenous control）有相同相近的扩增效率E。扩增效率的推算：1公式法 Rn= R0*（1+E）n 对两边取对数： lgRn = lg (1+ E) n +lgR0n=CT时候 lgRct = lg (1+ E) CT +lgR0 由可知 lgRn为Y轴 n为X轴 作图可以看到lg (1+ E)即公式 的斜率S。 因此得到 E = 10s-1 由公式可知 到达阈值时产物是一定定值的（阈值的定义）lgRct = lg (1+ E) CT +lgR0所以 ： lgR0 是和CT 成正比的，这也是可以根据CT值判断初始模板量的原理。2观察法观察目的基因和内参基因的扩增曲线，如果指数期的曲线形状一致，可以认为两个基因的扩增效率类似。这对于做很多基因的扫描绘制基因热图很实用也很简单，省去了每个基因的扩增效率的确定。如下图4图4 基因的对数期扩增曲线形状一致上面的作为理解实时荧光PCR的基础，下面说一下具体试验中的应用三、2-CT方法实用举例例一 用药物处理肺癌细胞，计算处理对UTF-1 mRNA的影响。药物处理和未处理样品CT 值分别23.5 ，28.3。药物处理和未处理样品内参基因-action的CT分别为19.5，21.3 处 理 组 CT =23.5-19.5=4未处理组CT=28.3-21.3=7CT=处理组CT-未处理组CT=4 - 7= -32-CT=2-(-3) =8药物处理UTF-1基因表达变化倍数=2-处理UTF-1CT-内参CT-未处理UTF-1CT-内参CT =2-23.5-19.5-28.3-21.3 =2- (-3) =8 因此可以理解为药物处理使UTF-1的表达是未处理的8倍如果2-CT计算下来是2-3，那么可以解释为处理的是未处理的1/8，或者说处理后目的基因表达下降8倍例二 如果5例HER2（+）组和5列HER2 （）组Bcl-2基因和-action的CT值已被测定如何评价HER2（+）组Bcl-2的表达是HER2(-)组的多少倍？因为不知道阳性组5例对应阴性组5例作CT，所以要用到：2-CT转换数据用mean sd 表示 2-CT=2-CTbcl-2-CT-actionCTBcl-2CT-actionCT2-CTHER2（+）组18.312.362-617.513.542-419.312.372-7HER2(-)组23.314.392-922.512.5102-1024.615.692-9计算 HER2（+）组2-CT的均值为44X2-9HER2（-）组2-CT的均值为2.5X2-9 因此HER2（+）组BCL-2的表达是HER2（-）组的44/2.5=17.6倍四、存在的问题1 .如果目的基因和内参基因的扩增效率不一致，怎么解决?一般的解决方案是优化PCR条件，重新设计引物，PCR体系添加氯化镁等等来获得相同的扩增效率。在这里可以告诉大家，即使扩增效率不一致，我们可以用另外的一种分析方法见参考文献1。2. 内参基因是否受到处理因素的影响呢，如何选择一个合适的内参基因？可以参考2 刚接触实时荧光PCR不久，可能对其理解有限，本文中会存在一些错误与不足，希望大家指正。主要文献是下面两篇，其他的就没附上，如果对你有帮助就点个赞吧！1.Quantitative real-time RT-PCR data analysis: curr