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实验24淀粉酶活性的测定 植物中的淀粉酶能将贮藏的淀粉水解成麦芽糖。淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性最强。植物中有 淀粉酶和 淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。通过本实验掌握淀粉酶的提取和测定方法。 一、原理 淀粉酶和 淀粉酶，各有其一定的特性，如 淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而 淀粉酶不耐酸，在 pH3.6 以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，可根据它们的特性分别加以处理，钝化其中之一，即可测出另一酶的活性。将提取液加热到 70 维持 15 min 以钝化 淀粉酶，便可测定 淀粉酶的活性。或者将提取液用 pH3.6 之醋酸在 0 加以处理，钝化 淀粉酶，以求出 淀粉酶的活性。 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用 3 ， 5 二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成 3 氨基 5 硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。 以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 萌发的小麦（芽长 1 cm 左右）。 （二）试剂 1. 1 淀粉：称取 1.0g 淀粉溶于 100mL 0.1mol/L pH 5.6 的柠檬酸缓冲液中。 2. 0.1mol/L pH5.6 的柠檬酸缓冲液： A 液：称取柠檬酸 20.01 g ，溶解后稀释至 l000 mL ； B 液：称取柠檬酸钠 29.41 g ，溶解后稀释至 1000 mL 。取 A 液 55 mL 与 B 液 145 mL 混匀，即为 pH5.6 之缓冲液。 3. 3, 5 二硝基水杨酸溶液：精确称取 3, 5 二硝基水杨酸 1 g 溶于 20 mL 2 mol/L 氢氧化钠中，加入 50 mL 蒸馏水，再加入 30 g 酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至 100 mL ，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。 4. 麦芽糖标准液：称取麦芽糖 0.100 g 溶于少量蒸馏水中，仔细移入 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。 （三）仪器设备 小台秤，研钵，容量瓶 100 mL ，具塞刻度试管，试管，刻度吸管 l mL 2 mL 10 mL ，离心机，恒温水浴，分光光度计。 三、实验步骤 1. 酶液的提取 称取 1.0 g 萌发的小麦种子，置研钵中加 2 mL 蒸馏水和少量石英砂， 研磨成匀浆后转入离心管中，用 7 mL 蒸馏水分次将残渣洗入离心管，提取液在室温下放置提取 15 20 min ，每隔数分钟搅动 1 次使其充分提取。然后在 3000r/ min 转速下离心 10 min ，将上清液倒入 50 m L 容量瓶中加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上速淀粉酶原液 5 m L ，放入 50 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度摇匀，即为淀粉酶稀释液。 2 麦芽糖标准曲线制作 取 7 支干净的具塞刻度试管，编号，按表 35 1 加入试剂： 表 35 1 制作麦芽糖标准曲线配方表 试 剂 管 号 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液（ mL ） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 蒸馏水（ m L ） 2.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 麦芽糖含量（ mg ） 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 3 ， 5- 二硝基水杨酸（ m L ） 2 2 2 2 2 2 2 摇匀，置于沸水浴中煮沸 5 min 。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 m L 。以 1 号管作为空白调零点，在 540 nm 波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。 3 酶活力的测定 取 6 支干净的具塞刻度试管，编号，按表 35 2 进行操作。 表 35 2 酶活力的测定配方表 操 作 项 目 管 号 -1 -2 -3 -1 -2 -3 淀粉酶原液（ m L ） 1.0 1.0 1.0 0 0 0 钝化 - 淀粉酶 置 70 水浴中 15 min ，取出后在流水中冷却 淀粉酶稀释液（ m L ） 0 0 0 1.0 1.0 1.0 DNS 试剂（ m L ） 2.0 0 0 2.0 0 0 预保温 40 恒温水浴保温 10 min 40 1% 淀粉溶液（ m L ） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 保温 40 恒温水浴中准确保温 5 min DNS 试剂（ m L ） 0 2.0 2.0 0 2.0 2.0 摇匀，置于水浴中煮沸 5 min , 取出后流水冷却，加蒸馏水定容至 20 m L 。摇匀，在 540 nm 波长下比色，记录 光密度值，从麦芽糖标准曲线中查出麦芽糖含量，用以表示酶活性。 四、结果计算 淀粉酶总活性 麦芽糖（ mg ） /(gmin) ( +) 淀粉酶总活性 麦芽糖（ mg ） /(gmin) 式中： A 淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖（在标准曲线上查得值）， mg 。 A 淀粉酶的对照管中麦芽糖量， mg 。 B ( +) 淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量， mg 。 B ( +) 淀粉酶的对照管中麦芽糖量， mg 。 V 测定时所用样品液体积， mL 。 t 酶作用时间， min 。 思考题 1. 萌发种子和干种子的 -