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运动对 2 型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号通路 PI3K PKB 磷酸化与表达 的影响 曹师承 1 赵 刚1 常 波2 张 合1 1 中国医科大学基础医学院运动医学基础教研室 辽宁 沈阳110001 2沈阳 体育学院运动人体科学系 辽宁 沈阳110102 摘要 目的 探讨运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌磷脂酰肌醇3激酶 PI3K 与蛋白激酶B PKB 磷酸化和蛋白表达及葡 萄糖转运蛋白4 GLUT4 和 mRNA表达的影响 方法30只SD雄性大鼠随机分为对照组 糖尿病组与糖尿病运动组 糖尿病组与糖尿病运动组大鼠经高脂饲料喂养8周后 一次性腹腔注射链脲佐菌素 STZ 30 mg kg 注射后3周确认 2型糖尿病建模成功 糖尿病运动组大鼠进行4周游泳训练 糖尿病组与糖尿病运动组大鼠建模过程始终喂养高脂饲 料 对照组大鼠喂养普通饲料 糖尿病运动组大鼠4周游泳训练结束 于最后一次运动后恢复48 h 取材各组大鼠腓肠 肌 采用Western blot法分析PI3K与PKB的磷酸化水平和蛋白表达 检测GLUT4蛋白表达 RT PCR检测GLUT4 mRNA表达 结果 与糖尿病组比较 运动改善2型糖尿病大鼠腓肠肌PKB磷酸化水平与蛋白表达 P 0 05 增加了 糖尿病大鼠腓肠肌GLUT4蛋白与mRNA表达 P 0 01 P 0 05 结论 运动可能通过改善2型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛 素信号通路蛋白激酶磷酸化和蛋白表达 增加对葡萄糖的吸收与利用 关键词 运动 2型糖尿病 磷脂酰肌醇3激酶 蛋白激酶B 中图分类号 R589 文献标识码 A文章编号 1673 4254 2010 06 1217 05 Effects of exercise on expression and phosphorylation of PI3K and PKB in insulin signaling in the skeletal muscles of type 2 diabetic rats CAO Shi cheng1 ZHAO Gang1 CHANG Bo2 ZHANG He1 1Department of Sports Medicine College of Basic Medical Sciences China Medical University Shenyang 110001 China 2Department of Human Sports Science Shenyang Sport University Shenyang 110102 China Abstract Objective To investigate the effect of exercise on the expressions of phosphatidylinositol 3 kinase PI3K and protein kinase B PKB phosphorylation protein and glucose transport proteins GLUT4 at both the protein and mRNA levels in the skeletal muscles of type 2 diabetic rats Methods Thirty male SD rats were randomly divided into control group with normal diet feeding diabetic group and diabetic exercise group with high fat diet feeding After 8 weeks of the high fat diet each rat received an intraperitoneal injection of streptozotocin STZ 30 mg kg Three weeks after the injection the rats were rated for the presence of diabetes and the rats in the exercise groups took swimming training for 4 weeks all the groups maintained their assigned diets The gastrocnemius of all the rats were dissected 48 h after the last training session Western blotting was applied to detect the phosphorylation and protein expression of PI3K and PKB and the protein expression of GLUT4 The expression of GLUT4 mRNA was determined by RT PCR Results Compared with the diabetic group the diabetic rats in the exercise group showed significantly increased protein expression and phosphorylation of PKB P 0 05 and elevated GLUT4 protein and mRNA expressions in the skeletal muscles P 0 01 P 0 05 Conclusion Exercise training can modulates insulin signal transduction through the protein expression and phosphorylation of the protein kinase to promote glucose uptake in the skeletal muscle of type 2 diabetic rats Key words exercise type 2 diabetes phosphatidylinositol 3 kinase protein kinase B 运动提高骨骼肌对胰岛素的敏感性 增加正常机 体与2型糖尿病患者吸收和利用葡萄糖 调节血糖平 衡 1 运动疗法已广泛用于2型糖尿病的预防和临床 治疗 研究证实 运动通过改善正常机体胰岛素信号 通路磷脂酰肌醇3激酶PI3K 蛋白激酶B PKB 的 磷酸化水平与蛋白表达 2 3 促进骨骼肌细胞葡萄糖 转运蛋白4 GLUT4 释放 易位与肌细胞膜融合 增 加葡萄糖的吸收与利用 调节糖代谢 4 然而 2型糖 尿病患者不同程度损害骨骼肌胰岛素信号通路级联 蛋白激酶的磷酸化 5 运动是否改善2型糖尿病骨骼 肌胰岛素信号通路磷酸化水平 促进葡萄糖吸收的分 子机制目前仍未清楚 本研究首先通过高脂饲料喂养 大鼠 采用小剂量链脲佐菌素 STZ 诱导高脂饲料喂 养大鼠发展为2型糖尿病 6 观察运动干预对糖尿病 收稿日期 2010 01 12 基金项目 国家自然科学基金 30971414 作者简介 曹师承 1958 男 博 士 副 教 授 E mail caoshicheng 2010 30 6 南方医科大学学报 J South Med Univ 1217 大鼠骨骼肌胰岛素信号通路PI3K PKB磷酸化与蛋 白表达的影响 探讨运动治疗糖尿病的分子机制 1材料与方法 1 1试剂与仪器 1 1 1试剂兔PI3K和磷酸化磷脂酰肌醇3激酶 P PI3K 兔PKB和磷酸化蛋白激酶B P PKB 山 羊多克隆抗体IgG葡萄糖转运蛋白4 GLUT4 和马 actin多克隆抗体 Santa Cruz 辣根过氧化物酶标记 山羊抗兔二抗 辣根过氧化物酶标记驴抗山羊二抗 辣根过氧化物酶标记山羊抗马二抗和ECL试剂盒 北京中山公司 TaKaRa RNA PCR试剂盒 大连宝 生物工程有限公司 血糖试剂盒 上海荣胜生物技术 有限公司 胰岛素试剂盒 解放军总医院科技开发中 心放免研究所 链脲佐菌素 上海前尘生物技术有限 公司 甘油三酯 总胆固醇 肌糖原试剂盒 南京建成 生物工程研究所 其它试剂为分析纯 1 1 2仪器低温高速离心机 PCR扩增仪 Sigma公 司 匀浆机 超声粉碎机 电泳仪 水浴式电转印槽 北京六一仪器厂 凝胶自动分析成像系统 Chen image 5500 GC 1200 放射免疫计数器 中国科技 大学科技实业公司 MD 100半自动生化分析仪 北 京鸿澳医疗公司 1 2实验动物与模型建立 1 2 1实验动物成年雄性SD大鼠30只 SPF级 体 质量310 340 g 由成都达硕生物科技有限公司提供 实验大鼠每笼饲养5只 给予正常节律日光照射 实 验室温度控制在22 24 所有大鼠经适应性喂养 3 d后 将大鼠随机分为3组 每组10只 正常对照组 喂养普通饲料 糖尿病组与糖尿病运动组 喂养高 脂饲料组 高脂饲料由10 熟猪油 20 蔗糖 2 5 胆固醇 1 0 胆酸盐和66 5 的普通饲料构成 1 2 2模型建立糖尿病组与糖尿病运动组经8周高 脂饲料喂养后 所有大鼠禁食12 d 自由饮水 每只 大鼠一次性腹腔注射30 mg kg 溶于0 1 mmol L枸 橼酸缓冲液 pH4 5 对照组大鼠禁食12 d后 每只 大鼠腹腔注射等量生理盐水 注射后3周 所有大鼠 禁食12 d 自由饮水 测血糖 口服葡萄糖耐量试验 尾静脉取血 测空腹血糖后 每只大鼠灌注20 葡萄 糖溶液 2 g kg体重 测定服糖后0 min 15 min 30 min 60 min 120 min血糖值 大鼠血糖值在0 min 7 0 mmol L或120 min 11 1 mmol L认为糖尿病建 模成功 6 7 对糖尿病运动组进行运动训练4周 继续 喂养高脂饲料 对照组大鼠始终喂养普通饲料 1 2 3运动方案运动组大鼠在水温 32 1 和水深 50 cm的有机玻璃游泳池内游泳 每只大鼠保证有 200 cm2的活动面积以利于持续活动 每周游5 d 休 息2 d 每天1次 正式运动训练前进行2次适应性 运动 每次运动30min 以后每次运动时间固定为1h 运动4周 1 3检测方法 1 3 1生化指标检测运动组最后一次运动结束恢复 48 h后 测定各组大鼠体质量 所有大鼠禁食12 h 用 异戊巴比妥进行动物麻醉 每千克体质量给药15 mg 15 mg kg 大鼠尾静脉采血 分离血清 采用葡萄糖 氧化法 用半自动生化分析仪测定血清葡萄糖 放射 免疫法测定血清胰岛素 半自动生化分析仪测总胆固 醇与甘油三脂 1 3 2 Western blot分析采用Western blot法分析大 鼠腓肠肌PI3K P PI3K PKB P PKB和GLUT4 取 麻醉状态各组大鼠腓肠肌迅速放入液氮罐暂存 待取 材结束移入 80 低温冰箱保存 取 80 保存的腓 肠肌样品 每份组织以1 5比例加入裂解缓冲液 200 mg加1mlbuffer 20mmol lTris HclPH 7 550mmol l NaCl 0 1 mmol l Na3Vo425 mmol l NaF 2 mmol l EDTA EGTA 1 mmol l DTT 1 mg ml亮肽素 抑肽 酶 经匀浆和超声粉碎 4 12 000 g 离心1 h 取 上清 蛋白定量采用酚试剂定量法 Lowry 取各组 样品40 g总蛋白上样于10 SDS PAGE电泳分离 后 转移至硝酸纤维膜上 转印膜在封闭液 5 的脱 脂奶粉溶液 中过夜 加入一抗 孵育2 h 洗膜 加入 二抗 孵育1 h TTBS洗2次 TBS洗1次 化学发光 试剂ECL A液和B液等量混合点于转印膜上 室温 孵育1 min 倾掉ECL 保鲜膜覆盖后置暗盒中暴光 X 光片扫描成像 经凝胶自动分析成像系统和 ImageJ图像分析软件对图中印迹区带进行定量分 析 1 3 3 RT PCR分析RT PCR检测GLUT4mRNA表 达 1 总RNA提取 取适量样品加 Trizol 上海生工 公司 溶解后 严格按照说明书进行操作 紫外检测仪 分别在260 nm和280 nm波长下检测RNA的光密 度吸收值 测定RNA的纯度及浓度 2 cDNA合成 采用TaKaRa RNA PCR试剂盒进行逆转录 42 反 应30 min 99 5 min 5 5 min 合成的cDNA置于 20 冰箱保存 3 PCR扩增 引物均由大连宝生物 公司合成 Glut 4 产物225 bp sence 5 GAAACGG AAGTTGGAAAGA 3 antisence 5 CTACTAAGAGC ACCGAGACC 3 actin 产物701 bp sence 5 GC CAACCGTGAAAAGATG 3 antisence 5 CCAGGAT AGAGCCACCAAT 3 94 预变性2 min 循环35次 循环条件为 94 变性30 s 55 退火30 s 72 延伸 1 min 循环 南方医科大学学报 J South Med Univ 第30卷1218 P 0 05 P 0 01 vs control P 0 05 P 0 01 vs diabetes 表1体质量 血糖 胰岛素 总胆固醇 甘油三脂与肌糖原变化 Tab 1 Changes of body weight muscle glycogen and serum glucose insulin total cholesterol and triglycerides levels n 10 Mean SD GroupBody weight g Glucose mmol l Insulin mmol l Total cholesterol mmol l Triglycerides mmol l Muscle glycogen mg g Control444 07 27 535 32 0 617 83 1 991 33 0 250 78 0 201 58 0 39 Diabetes409 97 9 89 7 29 1 34 11 22 2 78 1 38 0 311 01 0 360 89 0 42 Diabetes exercise422 99 12 71 6 00 0 75 8 59 2 05 1 27 0 210 52 0 18 1 27 0 23 P 0 05 vs control P 0 05 P 0 01 vs diabetes 表2 PI3K PKB磷酸化和蛋白表达及GLUT4蛋白和mRNA表达 Tab 2 PI3K and PKB phosphorylation protein expression and GLUT4 protein and mRNA expressions n 10 Mean SD GroupP PI3KPI3KP PKBPKBGLUT4GLUT4mRNA Control135 47 11 5381 91 7 25128 25 13 0278 76 10 5578 68 6 750 41 0 06 Diabetes122 38 11 68 73 83 6 54 113 40 11 53 68 26 8 77 75 58 5 720 36 0 05 Diabetes exercise130 99 12 7178 09 7 05125 27 12 21 77 52 7 18 83 84 6 59 0 43 0 06 结束后72 延伸10 min 4 PCR产物分析 PCR产 物用1 5 琼脂糖凝胶电泳 溴化乙锭染色检测结果 利用ImageJ图像分析软件分析 取GLUT 4 mRNA 和actinmRNA吸光度比值对产物进行相对定量 1 3 4肌糖原测定取冷冻腓肠肌称重 经酸解作用 处理后 采用荧光法检测各组大鼠腓肠肌糖原含量 1 4统计学处理 实验结果以均数 标准差表示 应用SPSS 13 0 版统计软件包进行数据处理 采用完全随机设计的方 差分析 P 0 05表示差异具有统计学意义 2结果 2 1体质量 血糖 胰岛素 总胆固醇 甘油三脂与肌 糖原检测结果 第15周检测实验大鼠体质量 血液生化指标与 肌糖原 结果发现 与对照组比较 糖尿病组大鼠体质 量和肌糖原下降 差异均有统计学意义 P 0 01 血 中血糖 胰岛素 总胆固醇和甘油三酯水平均升高 其 中血糖和胰岛素差异有统计学意义 P 0 01 与糖尿 病组比较 糖尿病运动组体质量和肌糖原明显增加 P 0 05 血中血糖 胰岛素 总胆固醇和甘油三酯水 平下降 其中血糖和胰岛素 P 0 05 甘油三酯 P 0 01 差异有统计学意义 表1 2 2 Western blot分析 2 2 1运动对大鼠腓肠肌PI3K磷酸化与蛋白表达的 影响与对照组比较 糖尿病组大鼠腓肠肌PI3K磷 酸化水平及PI3K蛋白表达下降 差异均有统计学意 义 P 0 05 与糖尿病组比较 糖尿病运动组大鼠腓 肠肌PI3K磷酸化水平和蛋白表达有上升趋势 差异 均无统计学意义 图1 表 2 2 2 2运动对大鼠腓肠肌PKB磷酸化与蛋白表达 与对照组比较 糖尿病组PKB磷酸化水平及蛋白表 达下降 差异均有统计学意义 P 0 05 与糖尿病组 比较 糖尿病运动组PKB磷酸化水平及PKB蛋白表 达增加 差异均有统计学意义 P 0 05 图2 表 2 2 2 3运动对大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达与对照 组比较 糖尿病组大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达有下 降趋势 差异无统计学意义 与糖尿病组比较 糖尿病 运动组大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达增加 差异有统 计学意义 P 0 01 图3 表2 图1运动对大鼠腓肠肌PI3K磷酸化水平与蛋白 表达的影响 Fig 1 Effects of exercise on PI3K phosphorylation and protein expression in the gastricnemius of the rats Lane 1 Control Lane 2 Diabetes Lane 3 Diabetes exercise P PI3K PI3K actin 123 曹师承 等 运动对2型糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号通路PI3K PKB磷酸化与表达的影响第6期 1219 图2运动对大鼠腓肠肌PKB磷酸化水平与蛋白表达 的影响 Fig 2 Effects of exercise on PKB phosphorylation and protein expression in the gastricnemius of the rats Lane 1 Control Lane 2 Diabetes Lane 3 Diabetes exercise P PKB PKB actin 123 2 3运动对大鼠腓肠肌GLUT4mRNA表达的影响 与对照组比较 糖尿病组大鼠腓肠肌GLUT 4mRNA表达有下降趋势 但差异无统计学意义 糖 尿 病 运 动 组 与 糖 尿 病 组 比 较 大 鼠 腓 肠 肌 GLUT 4mRNA表达增加 差异有统计学意义 P 0 05 图 4 表 2 3讨论 本研究通过高脂饲料喂养大鼠8周后 经过一次 小剂量腹腔注射STZ诱发大鼠发生2型糖尿病 实 验发现 糖尿病大鼠体质量明显下降 血糖浓度显著 升高 并达到糖尿病诊断标准 同时 血清胰岛素水平 升高和肌糖原含量下降 血清总胆固醇和甘油三脂浓 度呈上升趋势 经过4周有规律的运动干预 改善了 糖尿病大鼠体重与肌糖原含量 降低了血糖与胰岛素 水平 进一步证实运动干预具有促进葡萄糖的利用 调节糖代谢的作用 1 然而 运动促进糖尿病大鼠骨 骼肌吸收与利用葡萄糖的信号机制尚在探讨中 PI3K PKB是葡萄糖的吸收与利用 调节血糖平 衡的主要转导途径 骨骼肌是胰岛素刺激葡萄糖摄取 的主要靶器官 生理状态下 运动增加骨骼肌对胰岛 素的敏感性 促进胰岛素与肌细胞膜受体结合 激活 PI3K PKB信号途径级联蛋白激酶的磷酸化与表达 提高GLUT4跨膜转运调节糖代谢 2 4 说明运动对正 常机体通过胰岛素信号转导途径促进骨骼肌葡萄糖 吸收与利用中起着重要的作用 但是 胰岛素抵抗和 或2型糖尿病不同程度损害骨骼肌胰岛素信号通路 级联蛋白激酶的活性与表达 5 运动干预对胰岛素抵 抗和2型糖尿病骨骼肌胰岛素信号通路影响的研究 结果不甚一致 Saengsirisuwan等 8 采用跑台训练肥 胖Zucker大鼠60 min d 运动15天后 检测比目鱼 肌发现 运动增加PI3K活性 Adam等 9 通过高脂饲 料喂养雄性SD大鼠9周后 进行抗阻力运动12周 证实 训练期间继续喂养高脂饲料 运动训练提高腓 肠肌PI3K活性 然而 运动对超重非糖尿病与2型 糖尿病患者骨骼肌PI3K活性的研究结果与上述报 道不同 Christ Roberts等 10 对超重非糖尿病与 2型 糖尿病患者进行8周的有氧运动训练 最后一次运动 后恢复24 h取骨骼肌测PI3K活性发现 长期有氧运 动未影响PI3K的活性 O Gorman等 11 对肥胖非糖尿 病与肥胖2型糖尿病患者采用一次性急性和短期7 d 运动训练 结果证实两种运动方式均未影响PI3K的 活性 本研究检测STZ诱导的2型糖尿病大鼠模型 PI3K 发现糖尿病大鼠腓肠肌PI3K磷酸化水平与蛋 白含量下降 而4周运动干预后未改善PI3K磷酸化 水平 以上实验结果的不一致 是由于实验模型不同 还是运动方式 强度与运动后取材时间选择不同还需 进一步研究证实 本实验结果显示 经过4周运动训练逆转2型糖 尿病大鼠骨骼肌胰岛素信号通路PI3K下游激酶 PKB的磷酸化水平与蛋白表达 Lessard等 12 通过高 脂饲料诱导大鼠发生胰岛素抵抗 同样进行4周运动 训练增加PKB的蛋白含量 运动干预对糖尿病大鼠 骨骼肌PI3K和PKB磷酸化与蛋白表达作用结果的 不一致 提示运动可能同时激活肌细胞内其他信号通 图3运动对大鼠腓肠肌GLUT4蛋白表达的影响 Fig 3 Effects of exercise on GLUT4 protein expression in the gastricnemius of the rats Lane 1 Control Lane 2 Diabetes Lane 3 Diabetes exercise 123 GLUT4 actin 图4运动对大鼠腓肠肌GLUT 4 mRNA表达的影响 Fig 4 Effects of exercise on GLUT 4 mRNA expression in the gastricnemius of the rats M Marker Lane 1 Control Lane 2 Diabetes Lane 3 Diabetes exercise M123 bp 2 000 1 000 750 500 250 100 701 bp 225 bp GLUT4 南方医科大学学报 J South Med Univ 第30卷1220 路 由于不同信号通路间的交叉对话关系改善了 PKB的磷酸化水平与蛋白表达 PKB是促进GLUT4 释放 易位与肌细胞膜融合 增加葡萄糖的吸收与利 用的关键蛋白激酶 资料显示 耐力运动增加正常大 鼠骨骼肌GLUT4的蛋白表达 2 目前 尚无研究报道 运 动 训 练 对STZ诱 发2型 糖 尿 病 大 鼠 骨 骼 肌 GLUT4表达的影响 本实验发现 4周运动增加2型 糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4的蛋白和mRNA表达 本 研究认为 运动降低STZ诱发的2型糖尿病大鼠血 糖浓度 可能通过增加通路PKB磷酸化水平与蛋白 表达 提高GLUT4蛋白含量和跨膜转运 促进大鼠 骨骼肌吸收与利用葡萄糖 调节血糖平衡 参考文献 1 Fr覬sig C Rose AJ Treebak JT et al Effects of endurance exercise training on insulin signaling in human skeletal muscle interactions at the level of phosphatidylinositol 3 kinase Akt and AS160 J Diabetes 2007 56 8 2093 102 2 Luciano E Carneiro EM Carvalho CR et al Endurance training improves responsiveness to insulin and modulates insulin signal transduction through the phosphatidylinositol 3 kinase Akt 1 pathway J Eur J Endocrinol 2002 147 1 149 57 3 Langfort J Viese M Ploug T et al Time course of GLUT4 and AMPK protein expression in human skeletal muscle during one month of physical training J Scand J Med Sci Sports 2003 13 3 169 74 4 Thurmond DC Pessin JE Molecular machinery involved in the insulin regulated fusion of GLUT4 containing vesicles with the plasma membrane review J Mol Membr Biol 2001 18 4 237 45 5 Kirwan JP del Aguila LF Hernandez JM et al Regular exercise enhances insulin activation of IRS 1 associated PI3 kinase in human skeletal muscle J J Appl Physiol 2000 88 2 797 803 6 Xing XH Zhang ZM Hu XZ et al Antidiabetic effects of Artemisia sphaerocephala Krasch gum a novel food additive in China on streptozotocin induced type 2 diabetic rats J J Ethnopharmacol 2009 125 3 410 6 7 Srinivasan K Viswanad B Asrat L et al C

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