荧光定量pcr技术讲座0515ppt课件

实时荧光定量PCR技术的原理 应用及实践 RealtimeQuantitativePCR RealtimeQuantitativePCR 基本原理 Companyname 基本原理 Companyname Real timeqPCR的定义 Companyname 实时荧光定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析 Real timePCR仪ABI7500 PCR 基本原理 Denaturation 94 96 C Annealing 50 65 C Extension 70 75 C 基本要素 TemplatePrimersDNApolymerasedNTP N A G CorT Companyname 与普通PCR的比较 S形曲线 具有平台效应 终点检测法 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能 不同浓度的起始模板经PCR扩增后到达某一定值时所需要的循环数来计算起始模板量 定量原理 Companyname 理想的PCR反应 X X0 2n实际的PCR反应 X X0 1 Ex nn 扩增反应的循环次数X 第n次循环后的产物量X0 初始模板量Ex 扩增效率 定量原理 在扩增产物达到阈值线时 XCt X0 1 Ex Ct M 1 XCt 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量 在阈值线设定以后 它是一个常数 我们设为M方程式 1 两边同时取对数得 logM logX0 1 Ex Ct 2 整理方程式 2 得 logX0 log 1 Ex Ct logM 3 log 1 Ex Ct logX0 logMCt klogX0 b Companyname Companyname 每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系 起始拷贝数越多 CT值越小 确定初始模板的浓度 定量原理 Ct klogX0 b real timeqPCR使确定模板初始数量成为可能 11 实时荧光定量PCR中的三个概念 扩增曲线 primarycurve Companyname Companyname 荧光阈值 threshold 是在扩增曲线上人为设定的一个值 它可以设定在PCR反应指数扩增阶段任意位置上 但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3 15个循环荧光信号标准偏差的10倍 阈值线 原则 1 要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 2 同时要尽量选择进入指数期的最初阶段 CT值 CycleThreshold Companyname Ct值的定义 PCR扩增过程中 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Companyname Ct值的特点 相同模板进行96次扩增 终点处产物量不恒定 Ct值则极具重现性 检测方法 Companyname 非特异性荧光标记 SYBRGreenI特异性荧光标记 水解探针 TaqMan非水解探针 Molecularbeacon 17 解析方法 Companyname 将温度对荧光强度的变化求导 dI dT 确认PCR反应的特异性 融解曲线分析 Companyname 融解曲线分析 Companyname 初始模板量的对数与循环数 Ct值 呈线性关系 就可以制作以起始拷贝数的对数为横坐标 Ct值为纵坐标的标准曲线 标准曲线分析 计算样品的起始拷贝数 已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线 关键 DNA的精确定量 绝对定量 22 相对定量 以各自样本中内参基因为标准 比较不同样本中目的基因的相对表达丰度 23 相对定量的数据处理 Ct Ct PfafflModification VandesompeleMethod 非均一化的需要后续的均一化 以内参基因作为标准目标样品的相对定量通过内参基因的相对定量进行均一化只有一个内参基因假设扩增效率为100 扩增效率不同只有一个内参基因 扩增效率不同多个内参基因 简单 复杂 比较Ct法2 CtFoldinduction 23 8 Companyname 相对定量方法 Ct存在的问题 Companyname 成立条件 假设扩增效率为100 满足条件 1 内参基因和目标基因的扩增效率接近2 内参基因和目标基因的扩增效率为90 110 相对定量方法 实验流程 Companyname 应用 定量 基因表达水平检测定量 基因拷贝数检测多色标记 SNP检测高精度溶解曲线分析 HRM SNP高精度溶解曲线分析 HRM DNA甲基化分析 基因表达水平检测 Companyname 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 实验流程 逆转录 样本处理与RNA提取 外界刺激 可检测的表达改变样品离开定义环境 裂解 固定细胞Trizon裂解液 氰酸胍 异硫氰酸呱 SDS 液氮RNA保存液小心DNA污染 使用DNase以RNA作PCR阴性对照 CW0580 CW0592 逆转录 逆转录引物选择下游应用 是否检测其它基因 AbundantRNA的干扰 mRNAortotalRNA 检测灵敏度是否足够 是否会有二级结构干扰 一步法还是两步法 两步法 步骤多但灵活多样 cDNA可长期保留检测多个基因 便于反应优化 推荐 工作的初期阶段 RealSYBR二步法荧光定量PCR试剂盒 WithROX RealSYBR一步法荧光定量PCR试剂盒 WithROX RealSuper二步法荧光定量PCR试剂盒 WithROX 一步法 简便 快捷但只做一个基因 一旦失败难以查找原因 推荐 工作的成熟阶段 RealSuper一步法荧光定量PCR试剂盒 WithROX Mastermix的优化 Hotstar化学修饰 低温下酶活抑制强 热复活需10分钟FastHotstar抗体或oligo修饰 热复活仅需几十秒 CW0696 CW0704 热启动DNA聚合酶 反应条件优化 内参基因单一特异性产物反应效率90 110 反应条件优化 目的基因单一特异性产物反应效率接近内参基因反应效率尽量高 内参基因 高丰度ACTB GAPDH中等丰度beta2M低丰度HPRT1 36 扩增产物设计原则 总原则与普通PCR相同 二级结构 Companyname 扩增产物的二级结构 引物避免位于颈环结构上 Companyname 引物的位置 Companyname 55 60 65 温度对二级结构的影响 Companyname 实践 Companyname 实践 内参基因的标准曲线的绘制与数据分析 Companyname 样本 293T细胞株人提取方法 TrizonRNA提取试剂 CWBIO公司CW0580说明书 2 106个细胞总RNA琼脂糖凝胶电泳图 RNA提取 Companyname 逆转录 HiFi MMLVcDNA第一链合成试剂盒 CWBIO公司CW0744说明书 取5ul扩增产物 用1 7 琼脂糖凝胶进行电泳 体系 2 TaqMasterMix10ulGAPDHF引物 10um 0 5ulGAPDHR引物 10um 0 5ulcDNA1u加入灭菌水至20ul 逆转录 Companyname 模板 反应体系的配置 cDNA模板2 0 l正向引物F 10 M 0 5 l反向引物R 10 M 0 5 lREALSYBRMixture 2 10 0 lddH2O7 0 lTotal20 0 l Companyname 注意 1 为了避免加样误差 做预混体系2 充分混匀 如有气泡短暂离心 Companyname 95 5min95 10 15sec60 20 30secPlatereadGoto2for39cyclesmoreMeltingcurveanalysis from72 to95 readevery0 2 hold1secbetweenreadsEnd Tm值 DNA解链一半时的温