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绵羊羊膜上皮细胞的分化潜能及在骨缺损模型治疗中的应用 分类号 S852.1 学校代码10129 U D C号11.220 学 号 2009301027 绵羊 羊膜 上皮 细胞 的分 化潜 能及 在骨 缺损 模型 治疗 中的 应用The differentiation potential of ovine amnion epithelial cells and itsapplication in treatment of bone injury model申 请 人: 朱 雪敏 学科 门类 :农 学 学科 专业 :基 础兽 医学 研究 方向 :动 物组 织胚 胎与 发育 生物 学 指导 教师 : 曹 贵方 教授 论文 提交 日期 :二 ?一 二年 三月 摘 要羊膜上皮细胞(amnion epithelial cells,AECs)是由废弃的胎盘羊膜衍生的具有干细胞特性的细胞。AECs不仅具有多向分化潜能,而且许多研究都证实其具有免疫豁免性,移植后不产生免疫排斥反应,因缺乏末端转移酶端粒,移植后不致瘤,再加上来源广、易获得,不存在伦理争议等,而成为细胞研究工作者的研究热点之一。应用AECs进行一些疑难症的治疗是临床研究工作者的最终目标。临床应用治疗顺利进行的前提是以安全可靠的动物实验为基础。目前,AECs的研究主要以人的为主,在临床治疗研究中以人AECs治疗肝病、肺病、心脏病、糖尿病、神经系统疾病等疑难病症。而绵羊AECs的研究在国内尚未见报道,国外的相关研究也极少。因此,本研究对绵羊AECs的分离培养、干细胞特性的鉴定、体内分化及体外定向诱导分化进行了系统的研究。 1.绵羊羊膜上皮细胞的分离与培养 实验参照人羊膜消化分离获得原代细胞的方法,对绵羊羊膜的消化分离方法进行了探索,最终选用胰酶替代物 TrypLE 消化绵羊羊膜分离获得原代细胞,获得的原代细胞活力高,纯度好。细胞培养过程中选用了15%的胎牛血清浓度的培养液进行细胞的培养,很好地维持细胞良好的生长态势。 在不同密度梯度培养情况下,通过观察比较,确定了细胞接种的最适密度培养密度范围。在最适密度培养范围内,进行细胞生长周期的观察发现:绵羊 AECs 的潜伏期是1-2d,指数生长期是3-5d,以后为平台期。 通过细胞冻存实验确定了细胞的冻存方案,采用 DMSO 作为冻存保护剂,FBS:DMSO9:1的比列为冻存液,并且取-80到液氮的简捷冻存途径,有效地保存了绵羊AECs。2.绵羊羊膜上皮细胞的干细胞特性的鉴定 采用细胞免疫荧光和 RT-PCR 技术分别检测绵羊 AECs 的 ES 细胞表面标志物Oct-4、SSEA-1、 SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 和TRA-1-81及干细胞全能性相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog和Rex-1等。检测结果显示绵羊AECs的Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60 和 TRA-1-81 的 ES 细胞标志物均有表达。干细胞全能性相关基因Oct-4、Sox-2和Rex-1表达,而Nanog基因未见表达。检测结果提示,绵羊AECs具有干细胞特性的多向分化潜能。 3. 绵羊羊膜上皮细胞在体外的定向诱导分化研究 为了检验绵羊AECs在体外的多向分化潜能,在一定条件下,利用一些外源因子诱导绵羊AECs向神经系统细胞、成骨细胞和脂肪细胞进行定向分化。然后分别用细胞免疫荧光检测和RT-PCR技术、细胞AKP活性检测、茜素红染色、油红O染色等方 法进行了诱导分化细胞的鉴定。结果显示:神经方向诱导分化 28d后,细胞免疫荧光显示神经细胞特异性标志物-III-tubulin和神经胶质细胞特异性标志物GFAP均呈阳性表达;RT-PCR显示nestin和-III-tubulin和MAP- 2等基因均有表达。成骨诱导分化细胞AKP活性检测显示,诱导分化培养的第28d细胞AKP活性略有升高,第35d开始明显高于对照组,而且随培养时间的延长而继续增高,诱导组和基础培养组差异显著;茜素红染色有明显的钙化结节形成。脂肪细胞诱导分化的第 42d,油红O染色观察到有脂滴形成;细胞内AKP活性检测结果显示,基础培养组细胞AKP活性最高,各诱导组细胞AKP活性明显低于基础培养组。从上述鉴定中细胞的阳性及染色结果和诱导分化细胞的形态特征,可以推测本研究可以将绵羊 AECs诱导分化为了表达-III-tubulin阳性的未成熟神经细胞及MAP-2阳性的成熟神经细胞、GFAP阳性的神经胶质细胞,有钙化结节形成的成骨细胞及有脂滴形成的脂肪细胞。 4. 绵羊羊膜上皮细胞治疗兔桡骨缺损模型的研究 国外有文献报道,将绵羊 AECs 直接注射到绵羊体内,来治疗绵羊跟腱损伤的报道,且治疗效果极佳。为了进一步检验我们获得的绵羊 AECs 是否能够在异种动物兔体内进行分化,从而达到类似的治疗效果。手术制作30只兔桡骨13mm缺损模型,随机分成 3 组,即高剂量组,低剂量组和对照组。将 AECs 处理后,按设定剂量通过静脉注射进行细胞移植。在细胞移植前、手术后、细胞移植后 2 周、4 周、8 周拍摄 X光片,细胞移植后的 2 周、4 周、8 周进行组织形态学观察。结果提示:移植的绵羊AECs 高剂量组在第 8 周无论从 X 光片还是新生骨组织切片,缺损组织都修复完好,高剂量组优于低剂量组,低剂量组修复效果优于对照组。因此可以推测绵羊 AECs 在兔桡骨缺损模型的体内,向成骨方向进行了分化,加速了骨缺损的修复速度和质量。提示绵羊AECs治疗小段骨缺损是可行的。 综上,本研究成功获得了具有干细胞特性的绵羊 AECs,其无论在体内还是在体外均具有多向分化能力。本研究结果补充了绵羊 AECs 在干细胞特性方面及在体内和体外分化的理论知识,为临床进一步应用研究奠定了理论基础,提供了实践依据。关键词:绵羊;羊膜上皮细胞;干细胞特性;分化潜能;神经细胞;成骨细胞; 脂肪细胞The differentiation potential of ovine amnion epithelial cells and its application in treatment of bone injuryAbstract The amnion epithelial cellsAECs is a type of cells possessed with stem cell characteristics and derive from superseded placenta amnion. AECs are not only have multi-directional differentiation potentiality, but possess immune exemption potency that immunological rejection and tumorigenesis are not generated after post transplant because of terminal transferas telomere defected, and AECs are gained readily and not cause ethics dispute, which make it become one hot spot of cell researches. To apply AECs curing some serious disease is the final objective of clinical researchers. Furthermore, successful clinical application and treat are base on safe and reliable animal experiment. At present, human amnion epithelial cells are studied chiefly and adopted to treat liver disease, pulmonary tuberculosis, heart disease, diabetes, nervous system disease and so onHowever, the research on ovine amnion epithelial cells is not report in domestic and scarced in internationally. Therefore, isolating, culture and assessing stem cell characteristics, differentiation in vivo and direction location induction and differentiation in vitro of ovine amnion epithelial cells are proceed system research in this study1. Isolating and culture of ovine amnion epithelial cells The isolating and digestion methods of ovine amnion epithelial cells in accordance with the means of digestion human amnion epithelial cells were explored. And pancreatic enzyme surrogate TrypLE was adopted lastly to digest ovine amnion and isolate primary cell that are obtained with the features of high vigor and purity coefficient. The culture solution contained with 15% fetal bovine serum was applied and maintained excellently the favourable growth tendency of ovine amnion epithelial cellsThe optimum density and scope of cultural density of cells inoculation were detected through observation and comparision in different density gradient culture experiment. It was found, via observing cell growth cycle in optimum density scope, that the incubation period of ovine amnion epithelial cells was 1 to 2 days, and exponential growth phase was 3 to 5 days, afterward maintaining invariablyThe freezing and storing scheme of cells was definited by freezing and storing experiments, which DMSO was conducted as freezing and storing protective additive and FBS and DMSO were mingled according to certain ratioFBS: DMSO9:1 as freezing and storing solution.Moreover, to adopt the simple and quick freezing and storing ways thatremoved cells from -80 to liquid nitrogen were efficiently preserve ovine amnion epithelial cells2. Assessment the stem cell characteristics of ovine amnion epithelial cells Cell immunofluorescence and RT-PCR were performed to detect respectively the expression of embryonic stem cell of ovine AECs marker proteins Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 and totipotency related genes OCT-4, SOX-2, Nanog, Rex-1 and so on. The observed Oct-4, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 immunoreactivity of ovine AECs were predominant. RT-PCR experiments confirmed that the genes of Oct-4, Sox-2, Rex-1 were expressed and Nanog was not expressed. The results indicated that the ovine AECs have the multi-directional differentiation potentiality of stem cell properties3. Directional induction and differentiation of ovine amnion epithelial cells in vitroTo check the multi-directional differentiation potentiality of ovine amnion epithelial cells in vitro, ovine AECs were induced to directional differentiate into nervous systemcells, osteoblast and adipocyte utilizing some additional factors. Cell immunofluorescence and RT-PCR technologies, alkaline phosphatase activities detection, alizarin bordeaux stain, oil red O dyeing were performed respectively to accredit induced and differentiated cells. The results showed: the specific marker -III-tubulin in cellula nervosa and GFAP in nerve cement cells were observed positive immunofluorescence signals after 28 day in induced nerves direction; the genes of nestin, -III-tubulin and MAP-2 were expressed. alkaline phosphatase activities in bone formation induction and differentiation were elevate slightly after 28 day and begin to higher obviously than control group after 35 days. Moreover, the activities were to continue increase as cultural time prolong and the differences between induce and control group were evident; calcify nodus were visible in alizarin monosulfonate stain. it could be observed lipid droplet formation by oil red O dyeing in cellula adiposa induction and differentiation on 42d; alkaline phosphatase activities in foundation culture group were reach to imum and higher conspicuously than each induced group. From above research to the morphous characteristics of differentiated cells, we may safely draw the suppose that ovine amnion epithelial cells have already induced and differentiated into positive pro-mature neuron cells expressed -III-tubulin, positive mature neuron cells expressed MAP-2, positive nerve cement cells expressed GFAP, osteoblast with calcify nodus and cellula adiposa with lipid droplet4. study of therapy efficacy applied ovine amnion epithelial cells in rabbit radius defected modelsInjecting directly ovine amnion epithelial cells into ovine vivo to cure achilles tendon injury had reported and therapeutic efficacy was extremely excellent. To test the possibility of acquired ovine amnion epithelial cells differentiation in rabbit vivo and similar therapeutic efficacy with reported above, the 13-centimetre long radius defected models were made artificially in 30 rabbits, divided into high dose group, low dose group and control group randomly. To carry out cellular transplant by intravenous injection according to setting dose after dealing with ovine aminion epithelial cells. Took the models for X-ray in 2 weeks ,4 weeks and 8 weeks before the ovine aminion epithelial cells transplantations , after operation and injection cells respectively and meanwhile observed histomorphologyThe resultes hint: defect tissues were repaired in the high dose group at 8 weeks, observed from the X-ray and histological section of new bone, and the quality and quantities of trabecular bones in high dose group were better and higher than in the low dose group and it was the same situation between the low dose group and the control group. Accordingly, it was presume that ovine amnion epithelial cells in rabbit radius defected models in vivo were differentiated into bone and accelerated repaired speed and quality of bone coloboma.And the study indicated that it is feasible to apply ovine amnion epithelial cells to heal small bone defectIn this study successfully gain ovine amnion epithelial cells possessed with stem cell characteristics are have the multi-directional differentiation potency in vivo and in vitroAnd the results in this research supply with the theory knowledges of AECs in stem cell characteristics and differentiation in vivo and in vitro, and establish rationale and provide practice base for clinical exploratory development Key Words: Ovine; Amnion epithelial cells; Stem cell characteristics; Differentiation potential; Nervous system cells; Osteoblast; Adipose cellDirected by: Prof. CAO GuifangApplicant for Doctor degree: ZHU Xuemin (Ph.D of Elementary Veterinary Medicine) Animal Science and Animal Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China 本项目由国家 863 项目: 家畜胚胎 干细胞 技术研 究 2008AA101005 资助from National(863)China: technological research of domestic animal embryonic stem cell 2008AA101005缩 略 语 表 ECCs embryon carcinoma cells 胚胎癌细胞 ESCs embryonic Stem Cells 胚胎干细胞 ASCs Adulted Stem Cells 成体干细胞 ICM inner cell mass 内细胞团 PGCs primordial germ cells 原始生殖细胞 EGCs embryonic germ cells 胚胎生殖细胞 EBs embryoids 类胚体 AKP alkaline phosphatase 碱性磷酸酶 LIF(Leukemia Inhibitory Factor) 白血病抑制因子 iPS(Induction Pluipotent Stem Cells) 诱导多能干细胞 Oct-4(octamer-binding protein 4) 八聚体连接蛋白 DMEM/F12(Dulbeccos Modified Eagles Medium / 达尔伯克改良伊格尔培养液及添加 Nutrient Mixture F-12 Hams - Liquid Media) F12 液体培养液 SSEA(Stage-specific embryonic antigen) 阶段特异性胚胎表面抗原 FBS(fetal bovine serum) 胎牛血清 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 二甲基亚砜 PCR (polymerase chain reaction) 多聚酶链反应 RT-PCR(reverse transcription-PCR) 反转录 PCR PBS( Phosphate buffered saline) 磷酸缓冲液 DPBS(Dulbecco Phosphate buffered saline) 无钙、镁离子磷酸缓冲液 NSCs(neural stem cells) 神经干细胞 HSCs(hemopoietic stem cells) 造血干细胞 MSCs(mesenhymal stem cells) 间充质干细胞 bMSCs(bone marrow mesenehymal stem cells) 骨髓间充质干细胞 AECs(amnion epithelial cells) 羊膜上皮细胞 HPCs(hematopoietic progenitor cell) 造血祖细胞 NSE(neuron-specific enolase) 神经元特异性烯醇酶 MAP-2(microtubule- associated protein -2) 微管相关蛋白-2 GFAP(glial fibrillary acid protein) 神经胶原纤维酸性蛋白 HLA-G(human leucocyte antigen) 人类白细胞抗原-G DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 4,6 二脒基-2-苯吲哚盐酸目 录1 引言1 1.1 干细胞的概念1 1.2 干细胞的分类2 1.2.1 胚胎干细胞2 1.2.2 成体干细胞3 1.2.3 胎儿干细胞. 10 1.2.4 iPS细胞. 11 1.2.5 羊膜上皮细胞17 1.3 干细胞应用研究的前景展望. 23 1.4 实验目的和意义25 2 绵羊羊膜上皮细胞的分离与培养. 26 2.1 材料 26 2.1.1 材料来源 26 2.1.2 主要试剂 26 2.1.3 主要试剂配制26 2.1.4 主要仪器设备及耗材27 2.2 实验方法27 2.2.1 采用不同的酶分离获得羊膜上皮细胞 27 2.2.2 采用不同的培养液对细胞进行传代培养. 27 2.2.3 采用不同的细胞培养密度培养细胞28 2.2.4 细胞生长曲线的绘制28 2.2.5 细胞的冻存与复苏. 28 2.3 实验结果29 2.3.1 绵羊羊膜上皮细胞的生长特点 29 2.3.2 不同的酶消化分离细胞的结果 30 2.3.3 不同血清浓度培养液的培养结果. 31 2.3.4 不同培养密度对细胞的影响31 2.3.5 计数法绘制细胞生长曲线. 32 2.3.6 细胞的冻存与复苏. 32 2.4 讨论 33 2.4.1 绵羊羊膜上皮细胞的分离与培养. 33 2.4.2 绵羊羊膜上皮细胞的冻存与复苏. 342.4.3 绵羊羊膜上皮细胞的生长特点 34 2.5 小结 35 3 绵羊羊膜上皮细胞干细胞特性的鉴定 36 3.1 材料 36 3.1.1 材料来源 36 3.1.2 主要试剂 36 3.1.3 试剂的配制. 36 3.1.4 主要仪器设备及耗材36 3.2 实验方法37 3.2.1 细胞免疫荧光检测干细胞标志物. 37 3.2.2 RT-PCR检测全能性相关基因37 3.3 结果 40 3.3.1 胚胎干细胞标志物检测结果40 3.3.2 RT-PCR检测全能性相关基因的表达结果. 42 3.4 讨论 42 3.5 小结 44 4 绵羊羊膜上皮细胞分化潜能的研究45 4.1 材料与试剂 45 4.1.1 实验材料 45 4.1.2 主要试剂 45 4.1.3 主要试剂的配制 45 4.1.4 主要仪器设备与材料47 4.2 方法 47 4.2.1 向神经组织的诱导分化 47 4.2.2 向成骨细胞的诱导分化 50 4.2.3 向脂肪细胞的诱导分化 51 4.3 结果 52 4.3.1 神经组织分化的鉴定结果. 52 4.3.2 成骨诱导分化的鉴定结果. 55 4.3.3 脂肪诱导分化的鉴定结果. 56 4.4 讨论 58 4.4.1 绵羊羊膜上皮细胞向神经组织分化的潜能58 4.4.2 绵羊羊膜上皮细胞向成骨细胞分化的潜能60 4.4.3 绵羊羊膜上皮细胞向脂肪细胞分化的潜能61 4.5 小结 625 绵羊羊膜上皮细胞在兔桡骨缺损模型治疗中应用的研究63 5.1 材料与试剂 63 5.1.1 实验动物 63 5.1.2 主要试剂 63 5.1.3 主要试剂的配制 63 5.1.4 主要仪器及器械 64 5.2 方法 64 5.2.1 实验动物分组64 5.2.2 兔桡骨骨缺损模型的制备. 64 5.2.3 绵羊羊膜上皮细胞的处理. 68 5.2.4 绵羊羊膜上皮细胞的移植. 68 5.2.5 观察指标 69 5.3 结果 69 5.3.1 动物术后反应69 5.3.2 模型制备的检查 69 5.3.3 细胞移植后的跟踪检查 71 5.4 讨论 77 5.4.1 骨缺损模型的建立. 77 5.4.2 关于骨缺损治疗与修复研究77 5.4.3 羊膜上皮细胞的生物学特性78 5.4.4 羊膜上皮细胞的临床治疗应用研究79 5.4.5 绵羊羊膜上皮细胞治疗兔桡骨缺损模型的研究. 80 5.5 小结 81 6 结 论 82 致 谢 83 参 考 文 献 84 作 者 简 介 99内蒙古农业 大学博 士 学位论文 1 1 引言 1 21981 年,Evans 和 Kaufrnan 用延迟附植的胚泡blastocysts、Martin 用胚胎癌细胞embryonal carcinoma cells,EC 细胞条件培养液,首次成功分离并建立了小鼠胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ES细胞)系之后,国际上就掀起了干细胞的研究热潮。1998 年第一例人类干细胞前体细胞株成功分离和培养,干细胞的研究被推向当今生物医学研究的最前沿。1999 年和 2000 年,干细胞的研究名列美国科学杂志世界十大科学突破之首。干细胞的研究及利用干细胞进行疾病治疗的细胞组织工程已经成为生命科学中最为活跃的研究领域之一,成为当前国际科技竞争的焦点。干细胞的多潜能特性已经被广泛应用于人类疾病动物模型的建立、基因治疗、组织工程学、药学研究、发育生物学和移植医学等领域的研究。而且干细胞的研究对于重新认识细胞生长、分化和生物发育机制等基本生命规律也将起到重大作用。那么什么是干细胞?干细胞的概念是什么?与其它细胞有什么不同呢?下面我们了解一下干细胞及其一些研究状况。 1.1 干细胞的概念 机体生长和发育过程往往靠细胞的生长和分化来完成,细胞在分化过程中,从开始分化到高度分化至最终完全失去增殖及再分裂的能力,最后导致衰老死亡。机体在生长和发育过程中为弥补这一不足而保留了一部分未分化的原始细胞,被称为干细胞。一旦生理需要时,这些细胞可按照发育需要进行分裂而分化为机体急需类型的细胞,以保证机体的健康生长。干细胞也经常被认为进行不对称分裂,即产生一个干细胞后代和一个定型祖细胞,但不对称分裂不是干细胞的必须特征,还有人认为干细胞的定义应容纳单能性和多能性,正常组织细胞的更新主要由单能性干细胞完成,而损伤后组织再生可能也有多能性干细胞的参与。以前有科学工作者对干细胞进行了定义:干细胞是指具有自我复制能力的一类细胞群体,能够产生至少一种高度分化的子代细胞类型。后来随着对干细胞的研究和探索工作的进行,科学家们逐渐对其进行了一些更为合理的解释。2001 年 6 月 17 日,美国国立卫生院在干细胞科学进展和前景指南一书中对相关概念进行了描述:干细胞Stem Cells是来自胚胎、胎儿或成人的、具有持续自我更新能力的细胞,具有多向分化潜能产生特异的细胞类型或形成人体组织和器官。简而言之,干细胞是指在生命成长和发育的过程中起“主干”作用的原始细胞,能够无限增殖、自我更新和多向分化;其中,干细胞(Stem Cells)的“干”译自英文“Stem”,意为“干”、“起源”,即起源细胞,是指尚未完全分化、尚不成熟的原始细胞,能够分化形成人体各个组织器官。因此,干细胞在医学界被称为“万能细胞”。在再生医学和细胞替代治疗及白血病、帕金森氏症和癌症等绝症治疗上具有非常重要的研究价值及广泛的应用前景,因此,干细胞研究受到各个国家的高度重视,成为当前国际科技竞争的焦点。 2 绵羊羊膜上 皮细胞的 分化潜能 及在骨缺 损模型治 疗中 的应用 1.2 干细胞的分类 根据分化潜力的不同,干细胞分为全能性干细胞totipotential stem cell、多能性干细胞multipotential stem cell和单能干细胞unipotnetial stem cell。其中全能干细胞具有形成完整个体的分化潜能,能无限增殖分化成全身 200多种细胞类型,从而可以进一步形成人体的任何组织或器官,并最终发育成为一个完整的人,如人的受精卵就是一个最初始的全能干细胞;多能干细胞(Pluipotent Stem Cells),也就是人们常说的 ES细胞主要来自早期胚胎,它们具有分化出多种细胞组织的潜能,但却失去了发育成为新个体的能力;专能干细胞(Multipotent Stem Cells)又称为成体干细胞(Adulted Stem Cells,AS 细胞),是指能够形成数量有限的专门细胞的干细胞。也就是说,它只能向一种类型或密切相关的两种类型的干细胞分化,其功能是取代那些损耗和受损的完全分化的细胞。目前,研究的干细胞还有胎儿干细胞和诱导多潜能干细胞Induction Pluipotent Stem Cells,iPS 细胞,胎儿干细胞来自胎儿器官的一种原始细胞。胎儿干细胞生长迅速,显示3和 ES 细胞类似的可塑性,在体内没有形成肿瘤的记录 。iPS 细胞是通过向体细胞中导入 Oct-4、Sox-2、c-Myc 和 Klf4 等基因,使体细胞重编程获得具有 ES 细胞样特性的多能干细胞。iPS 细胞的产生可谓干细胞领域的新里程碑。iPS 细胞不论在形态、增殖分化能力、细胞表面抗原、基因表达模式等方面,均与 ES 细胞有着极大的相似性,而且,iPS 细胞在体内外均能向三个胚层的细胞类型分化。iPS 细胞的出现为整个干细胞生物学和再生医学领域带来了革命性的影响。1.2.1 胚胎干细胞 ES 细胞是由早期胚胎的内细胞团(inner cell mass,ICM)或胎儿的原始生殖2, 4细胞(primordial germ cells,PG 细胞) ,经体外分离培养而获得的一种具有发育全能性或多能性的细胞。根据其来源分为 EC 细胞、 ES 细胞和胚胎生殖细胞(Embryonic germ cells,EG 细胞)。胚胎癌细胞(embryonal carcinoma,EC 细胞)由自发或诱发的生殖细胞瘤或称畸胎瘤中分离出来的一种多能性干细胞。ES 细胞是从附植前早期的囊胚或桑椹胚经过体外抑制分化培养分离克隆出来的多能性干细胞。EG 细胞是由胎儿生殖嵴等部位的原始生殖细胞经分离培养出的具有发育全能性或多能性的干细胞,而 EG 细胞是从胎儿 PG 细胞分离培养的具有发育多潜能性的干细胞,故将二者统称为 ES 细胞。 ES细胞呈巢状集落式生长方式,不同动物ES细胞的巢状集落也有所不同。体外培养小鼠ES细胞呈圆形或卵圆形,1至2个核仁,且核质比例高,这些细胞单层或者5多层紧密堆积呈巢状结构。人ES细胞单层培养呈扁平状群落,而且细胞界限清楚 。体外培养时,ES细胞有无限增殖性,即在体外适宜条件下,能在未分化状态下无限增殖;ES细胞通过形成嵌合体实现种系传递的功能;ES细胞具有遗传可操作性;ES内蒙古农业 大学博 士 学位论文 3 6细胞具有正常的染色体数目和二倍体核型,即使冻存复苏后也保持此特性 。ES细胞具有特征性的分子标记是SSEA、TRA-1-60、TRA-1 -81、ECTM