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硕士研究生分子生物学考试内容大肠杆菌细胞在15N培养基（重培养基）中培养数代，产生含重氮（15N）的大分子（包括15N-DNA分子），而后移到正常培养基（14N）上培养，在不同时间提取DNA样品并在CsCl溶液中超速离心。Cscl溶液在超速离心下形成密度梯度。DNA分子在该密度梯度中迁移，并在与其密度与溶液密度相同点达平衡结果表明，DNA复制不可能是保留复制。因为保留复制产生的第一代DNA离心后将有两条带：一条“轻带”（14N），一条“重带”（15N），但实验结果表明第一代DNA只有一条具中等密度的带他们将15N标记的细菌在14N培养基上保持一代，然后提取DNA，加热到100度，使DNA双链变性为单链，再对变性的单链进行CsCl梯度密度超速离心.发现了两条分开的条带，表明一条链是15N标记的，另一条链是14N标记的，因此DNA复制是半保留复制，而不是分散复制。结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。对于双向复制而言，形成的两个复制叉向相反方向行进，每个复制叉上的两条DNA链均被拷贝。D型，单向，在动物线粒体中有双链环在固定点解开，进行复制，但两条链合成速度不对称，一条链复制60%后，第二条链才开始复制。复制子：由一个原点（origin)引发的 复制，称为一个复制子，即一个复制 单位。包含一个起点（origin）和一个终点（terminus）。原核只有一个复制原点，因此只有一个复制子。真核具有多个复制原点，因此有多个复制子hnRNA（核内不均一RNA）:成熟mRNA的前体。snRNA(核内小RNA)：参与hnRNA的剪接、转运。snoRNA（核仁小RNA）：rRNA的加工、修饰。scRNA（胞浆小RNA）：蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组分。mRNA前体剪接位点是由内含子末端的序列规定的。通过对100多种真核细胞基因的分析，发现所有内含子都是以GU开始，以AG告终的保守序列（称GT-AG规律，此规律不适合于线粒体和叶绿体的内含子，也不适合于tRNA和某些rRNA的结构基因）。同时内含子还有一个重要的内部位点分支点。 适应性表达(adaptive expression)指环境的变化容易使其表达水平改变的一类基因表达。应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因称为可诱导的基因(inducible gene)；随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，这类基因称为可阻遏的基因(repressible gene)组成性表达(constitutive expression)指不大受环境变化而变化的一类基因表达。组成性表达的产物组成性蛋白，是细胞或生物体整个生命过程中必不可少的，这类基因可称为看家基因(housekeeping gene) 真核生物的基因表达调控的不同层次真核生物DNA水平的调控在常染色质中表达的基因如移到异染色质则不表达；即紧密的染色质结构阻止基因表达。细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质(euchromatin)，松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质(heterochromatin)，其中未见有基因转录组蛋白是带正电荷的碱性蛋白质，可与DNA链上带负电荷的磷酸基相结合，从而封闭了DNA分子，妨碍基因转录。活跃转录的染色质区段中H1水平降低。 基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。使细胞在短期内产生大量专一基因产物以满足生长发育的需要。是基因活性调控的一种方式。非洲爪蟾卵母细胞rRNA 基因在DNA水平的调节研究发现扩增产生的新 rDNA 不在线形染色体上，而是一环状小DNA分子方式存在果蝇的不切离的多次复制使基因扩增 4. 生理适应性扩增 组织培养细胞在有适当抗生素或抗生素性物质存在时，可有选择的扩增某一基因8.2.4 基因重排和变换1. 1. 非定向重排。例如转座子在染色体上的移动，转座 子的插入可激活某些基因，也可抑制某些基因。如顺 向末端重复序列的转座可能导致某些片段的缺失而使 启动子邻近结构基因而使其转录。 转座子插入也可使某些基因失活，如插入基因内部则 使基因失活。 定向重排可使一个基因从远离其启动子的位置移到 距启动子很近的位点而被启动，典型的例子是小鼠免 疫球蛋白结构基因的表达。V基因、C基因和J基因在小鼠胚胎细胞中相距较远。当免疫细胞分化时，通过染色体定向重排把3个远离的基因连在一起，从而使细胞分化成专化的免疫细胞。重排的过程是淋巴细胞受到抗原刺激而分化为浆细胞时发生的。免疫球蛋白基因的精细重排使多个基因经重组编码一条肽链。V、C、J基因的不同组合造成了抗体的多样性。 基因表达的变换由于DNA片段缺失，使调控区和新的基因受体连接 形成新的调控启动基因，使原来无活性的基因转变 为有活性。基因修饰发生在DNA 水平，主要包括甲基化修饰 （主要出现在C组蛋白CpG）及转座子插入等。甲基化修饰因影响DNA 构象而影响DNA和参与起 始转录的一些蛋白质的相互作用，从而影响转录起始。说明甲基化抑制基 因表达。 乙酰化修饰可以激活基因（AC）8.3 真核生物转录调控真核生物的调控序列往往包含许多元件（保守序列），其上可结合各种调控蛋白。此元件称之为顺式作用元件(cis-acting elements) 。这些元件往往和结构基因保持一定的距离，其上可结合许多种与起始转录有关的蛋白。顺式作用元件包括启动子(promoter)的元件、增强子(enhancer)的元件以及起负性调控作用的沉默子(silencer)的元件等。能与顺式作用元件结合的可扩散蛋白称为反式作用因子真核RNA聚合酶不能识别 DNA上的结合位点，识别这些序列的是调节转录的反式作用因子，称为转录因子。但有些转录因子是识别并结合其他转录因子以形成转录装置的必需蛋白。转录因子分为几类 基础转录因子：也称通用转录因子，是启动子在起动 RNA合成时的必需因子，与RNApol结合形成围绕在起 始位点周围的复合物。其结合通用启动子序列，能在任 何细胞中转录，而不依赖于组织特异性的调控序列。但 单独作用转录效率低。 上游转录因子：识别并特异地结合在上游顺式元件上， 普遍存在，其活性不受调控。可作用于具有其识别序 列的任何启动子上。其作用是提高启动的效率。 诱导型转录因子(inducible facter)：其作用与上游因 子相同，但它们是受调控的。其在特定时间（细胞发 育阶段）、条件或特定的组织中合成或被活化。因而 有调控基因在不同时间、条件或不同地点起控制表达 的作用。诱导型转录因子结合的顺式元件叫做应答元件 一个仅含有被基础因子和上游因子所识别的元件的启动子能在任何细胞中进行转录。能被此类启动子起始转录的基因叫做持家基因（housekeeping gene)。8.3.2 调控蛋白的结构和作用方式1. 真核的转录起始是通过蛋白与DNA间以及蛋白与蛋白间的相互作用形成复杂的起始转录复合物而实现转录起始。2. 转录因子结构中可包含DNA结合域、转录激活域和连接区。连接区是连接DNA结合域与转录激活域的部分，一些转录因子还有二聚体结构域。3. 调控蛋白至少有2个不同的结构域：4. a. DNA结合结构域，与特殊DNA 调控序列5. 结合； 6. b. 调控蛋白之间的结合结构域 结构基因上游的调控序列由许多同源性强的元件序列组成，不同的元件在一定的细胞内环境下形成一定的构象，可以被DNA结合蛋白识别并结合。与转录因子结合的DNA区常是一段反向重复序列，因此许多转录因子常以二聚体形式与DNA结合。调控蛋白DNA结构域有两种其中2个His和2个Cys与Zn配位使锌指成环， 锌指由78个氨基酸联结同源异型域（Homeo domain）这一调控蛋白上与DNA结合的结构域称为同源异型域（homeodomain）。其序列在不同的生物中有很高的同源性（图8-21）。在进化中同源异型域的保守性十分突出同源异型域最早来自控制躯体发育的基因，长约60个氨基酸，其中的DNA结合区与HTH的结构很相似。将编码同源异型域的DNA序列称为同源异型盒（homeo box）。同源异型盒是DNA上编码一类与发育有关的调控蛋白（转录因子）上与DNA结合的结构域的序列。调控蛋白的DNA结合结构域和蛋白结合结构域是相互独立的， DNA结合结构域决定了启动基因的特异性，而蛋白结合结构域决定了作用蛋白的特异性和转录启动效率 1. 其中转录起始因子 (通用转录因子 transcription initiation facters TIFs）或一般转录因子（基础转 录因子 general transcription facters GTFs)帮助 RNA聚合酶定位到DNA上的转录起始位点。启动子中的元件: 核心启动子元件（转录起始点及-25区的TATA box） 上游启动子元件（-70区的CAAT box和GC box及更远的上游元件）。核心启动子元件(core promoter element) ：包括转录起始点（initiator，Inr，起始子）和TATA box。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录TBP（TATA box binding protein）是三种RNA pol识别DNA特异序列的基础转录因子，它与其它因子组成定位因子 基础因子（basal factor)：也称通用因子，与 RNApol结合形成位于起始位点周围的复合体 （Basal complex)，决定转录起始位点。也与下游 元件有关 上游因子（upstream factor)：识别并特异地结合在起 始位点上游元件上，是普遍存在的转录因子。其活性不 受调控，可结合和作用于具有其识别序列的元件（启动 子）上。其作用是提高启动效率（相当于TFA和 TFC），是强启动子所必需的。每个启动子在高效表 达时，都需要一套这样特定的因子 诱导因子（inducible factor)：作用与上游因子相 同。但是是受调控的。它们在特定的时间、条件 或特定的组织、发育的一定阶段被合成或被活化。 因此可调控受其作用的基因在不同时间、条件或 不同地点表达。 无诱导因子元件时 组成型表达（含有constitive gene house keeping gene无需诱导因子元件）：一个启动子， 若仅含有为基础 子和上游因子所识别的元件，则此启动 子能在任何类型 的细胞中进行转录（不受诱导）和表达。 此类基因称为 组成型基因或看家（持家）基因在真核生物中，还发现某些序列可大大增强启 动子的转录，这些序列可位于基因上游、下 游、甚至基因内部。在位置上可距起始位点很 远（几千个碱基），而且距离可变，将这样的 序列称为增强子。能显著提高基因转录效率的一类顺式调控元件.增强子的作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒置就不能起作用，即增强子与启动子不同增强子要有启动子存在才能发挥作用。但增强子对启动子无严格的专一性。增强子与其它顺式作用元件相同，必须与特定的蛋白因子结合后才能发挥作用。增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异蛋白因子所决定的。增强子是DNA上的特定序列，本身无增强转录作用，只能在与特异激活物蛋白结合后才能促进转录。而激活物蛋白仅在一定的细胞（分化的）才有增强子通过增强子激活蛋白与基础装置上的蛋白相互作用，使增强子靠近启动子而发挥作用。绝缘子可以阻断增强子、沉默子或LCR（基因座调 控区）的任何激活或失活效应途径，能阻断增强子 对 启动子的激活位于增强子和启动子之间的绝缘子可阻断增强子对启动子的激活。绝缘子通过与特定蛋白的作用可阻断增强子对启动子的激活，也能够屏障异染色质延伸引起的基因失活效应。它的作用具有方向性，不同于增强子，它屏蔽了增强子对不同启动子无选择性的顺式作用一些绝缘子具有方向性，并可能只终止一个方向 上的效应传播而不能终止另一个方向的效应播。 沉默子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用。应答元件的作用机理当某一基因需要表达时，则与应答元件结合的转录因子 合成或活化，与应答元件结合。此转录因子是聚合酶启 动转录的必需因子，其结合DNA，启动转录和蛋白合 成，使调节物效应出现DNA重组的类型同源重组（交换crossing over)它是由两条同源区的DNA分子，通过配对、链的断裂和再连接，而产生片段交换(crossing over)的过程。3.2.2 同源重组特点3.2.3 同源重组的功能1.两个同源染色体DNA排列整齐2.一个DNA的一条链断裂3.链侵入，并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子（joint molecule），称为Holliday中间体（Holliday intermediate）。4.通过分支移动(branch migration)产生异源双链(heteroduplex) DNA。5.Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。 异源双链（heteroduplex） ： 在重组部位，每个双链中均有一段DNA链来 自另一个双链中的单链。这个部分称为异源双链（杂种DNA）。分支迁移： 异源双链交叉连接中，交叉点沿着两条双链移 动，称为分支迁移（branch migration） Holliday结构： 两个DNA分子交叉重组时，在连接处则形成一个“四螺旋”作为中间物。这种结构称为Holliday结构（交叉结构）最后由核酸酶将交叉处切断（解离resolution）而完成重组作用。这种异构转变可导致两条子链发生双重交换，或所有四条链发生单交换。在专一酶的作用下，在D