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2 免疫学的发展和比较大黄蜂的分子克隆和一条短肽聚糖识别蛋白PGRP-S的表征和抗菌活性摘要肽聚糖识别蛋白（PGRPs）是模式识别分子的先天免疫肽聚糖识别系统，独特的细菌细胞壁的组成部分。现在我们克隆大黄蜂雄蜂的PGRP-S,该BiPGRP - S基因由四个外显子，编码194个氨基酸残基.对比分析表明，预测BiPGRP - S股氨基酸序列与酶活跃PGRP - S蛋白的身份高度认同，并包含酰胺酶活动所需的氨基酸。大黄蜂工蜂的脂肪体和表皮，它是分泌到血。实时定量PCR检测发现该BiPGRP - S基因都具有高度的脂肪体和表皮诱导后的苏云金芽孢杆菌。另外，重组BiPGRP-S可以以一个19KDa的蛋白质在昆虫细胞的被影响的杆状细胞和巨大芽孢杆菌和芽孢杆菌，而不是金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，白僵菌。根据这些数据，BiPGRP-S对磷细菌和芽孢杆菌有非常强的抗菌性。当有芽孢杆菌注入时，四抗菌肽基因在脂肪体的RNA干扰（RNAi）的表达谱介导BiPGRP -的S -击倒B.ignitus工蜂相似，控制工蜂.这表面BiPGRP-S不影响抗菌肽基因的表达，这些结果表明，BiPGRP- S是一个诱导蛋白，可作为一酰胺酶型PGRP- S对芽孢菌的免疫反应1. 介绍 先天免疫反应是抵御微生物的第一线，它通过模式识别分子来认识微生物，如T0ll样受体，胶原凝集素，肽聚糖识别蛋白，微生物分子配体的模式识别确认包括脂多糖，肽聚糖，-1,3-葡萄糖，PGRPS是天然免疫识别肽聚糖的一部分识别分子，细菌细胞壁的组成部分，从昆虫到哺乳动物，它们是高度保守的，PGRP首次发现了家蚕（家蚕）作为模式识别受体结合后触发的肽聚糖。接着，PGRPS已经确定在其他昆虫中，比如果蝇，夜蛾。以及哺乳类动物，包括老鼠和人类。昆虫PGRPS已经确立，信号和效应功能，哪个对先天免疫比较重要，果蝇有13个PGRP基因，可以转录成17个PGRP蛋白，果蝇PGRPs被划分为短期(PGRP-SA, -SB1, -SB2, -SC1a, -SC1b, -SC2 and -SD)或长期PGRPs(PGRP-LAa, -LAb, -LCa, -LCx, -LCy, -LD, -LF, -LAc, -LB and -LE)，7个短期PGRP- S蛋白有一个信号肽，缺乏跨膜区，并有可能被分泌。在果蝇里，3个短期PGRPs (-SA, -SD and -SC1)能够识别细菌的肽聚糖，并激活。然而PGRP-LC引发免疫性疾病的途径，果蝇PGRP-SC1, -SB1 and -LB是N-acetylmuramoyl-l-alanine amidases水解酰胺键在N-acetylmuramic酸和lalanine之间，论酰胺酶的活性位点的保守结构的基础，果蝇PGRPs (SB2, SC1b and SC2)，其他昆虫的PGRPs也被预言有酰胺酶活性，B. Mori和黄粉虫PGRP-S蛋白激活级联酶原，最近，受体型PGRP在蓖麻蚕萨米亚被确定。在这项研究中，我们克隆和描述了大黄蜂(BiPGRP-S)的 PGRP-S蛋白，BiPGRP-S基因通过搜索互补DNA文库ESTs生成。就像其他的PGRPs是由酰胺酶活性来识别的，被预言的BiPGRP-S蛋白有一个半胱氨酸（Cys)残基在和Cys130同源位置的T7溶菌酶，我们描述了在体内BiPGRP- S的转录诱导微生物响应挑战。另外，重组BiPGRP- S蛋白表达杆状病毒感染的昆虫细胞微生物具有约束力和杀菌活性测定，我们还描述的表达谱四抗菌肽基因时BiPGRP- S的转录通过减少脂肪体RNA干扰(RNAi).。2材料和方法2.1.动物 膜翅目：蜜蜂 熊蜂人工饲养条件下如前所述，黄蜂均保持在28，65相对湿度持续黑暗。2.2.cDNA文库筛选，DNA测序和数据分析 质粒DNA2.3.基因组DNA提取及聚合酶链反应（PCR） 基因组DNA是在B.ignitus脂肪体组织里提取的向导基因组DNA纯化试剂盒并以此为模板进行PCR。寡核苷酸引物进行扩增如下：正向引物1(121), 5-ATGACAAAGCTAATAGCGGTG-3，反向引物1 (10521076), 5-CGAGATTCCTAAGGGTTGACTTTGG-3;正向引物2(10521076), 5-CCAAAGTCAACCCTTAGGAATCTCG-3，反向引物22 (18601881),TCAGATCGACGACCAGTGAGGC-3.扩增引物设计采用BiPGRP - S的cDNA序列，所有PCR产物经DNA序列分析验证.2.4.生产和纯化重组蛋白昆虫杆状病毒表达载体系统使用夜蛾的核多角体病毒（AcNPV）和Sf9昆虫细胞株，用于生产重组BiPGRP- S蛋白,cDNA片段含有完整的开放阅读框长度是从pBlueScript-BiPGRP-S上切除 是插入到同一地点的转移载体pBac1 (Clontech, Palo Alto, CA, USA)到表达了AcNPV多角体启动子控制BiPGRPS，500毫微克的构造（pBac1- BiPGRP- S）和100 AcNPV DNA的30吴共转染为5小时到1.0-1.5106 Sf9细胞脂质体试剂的使用2.5.制备抗体和免疫印迹分析 纯化的重组Bipgrp-s蛋白质和弗氏完全佐剂混合然后注入小鼠，在为期一周的时间开始一周后，第一次注射，随后的两个分别给予注射抗原和弗氏不完全佐剂等体积混合，在最后一次注射后(只有抗原)三天后收集，在4摄氏度条件下凝集过夜在做离心10,000g10分钟，漂浮的抗体被贮藏在70摄氏度的地方。 免疫印迹分析采用增强化学发光（电化学发光）西方杂交分析系统，蛋白样品和样品buffer混合，煮沸5分钟，再装上一个12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质被涂抹上了硝酸纤维素转移膜。杂交后，膜被挡在了1牛血清白蛋白孵育（BSA）溶液中，培养与抗血清的解决方案2.6 收集，组织和血淋巴 脂肪体，肠，肌肉和表皮 用磷酸盐缓冲液清洗组织 (PBS; 140mM NaCl, 27mM KCl, 8mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, pH 7.4). 淋巴用冷的试管收集血淋巴在10,000 g离心10分钟，以除去血细胞和细胞碎片。收集未经进一步加工的组织样本2.7RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR法）组织用PBS清洗2次，从脂肪体，中肠，肌肉和表皮使用的总RNA提取试剂盒提取总RNA，为了检查大黄蜂组织里的BiPGRP-S表达，从总RNA中通过RT-PCR扩增BiPGRP-S的cDNA片段。a BiPGRPS cDNA序列如下：正向引物5_-ATGACAAAGCTAATAGCGGTG-3_ 反向引物5_-TCAGATCGACGACCAGTGAGGC-3_,-actin的正向引物(5_-AGACATCAGGGTGTGATGGTC-3_)，反向引物(5_-GATTTCTCGTTCAGCCGTGGT-3_)。RT-PCR方法进行如下94 C for 2min, 35 cycles of amplification (94 C for 1 min;55 C for 1mi