5.19藏药湿生扁蕾药材RP-HPLC指纹图谱的研究.doc

藏药湿生扁蕾药材RP-HPLC指纹图谱的研究郭亮 中药学本科2006级指导老师 景明摘要: 目的:建立藏药湿生扁蕾药材反相高效液相色谱 RP-HPLC 指纹图谱分析方法，为有效控制湿生扁蕾药材的质量奠定基础。方法:采用 RP-HPLC，色谱柱为ZORBAX SB-C18，甲醇-0.4%磷酸水溶液梯度洗脱，紫外检测波长为 260 nm，流速为 1.0 mL/min，记录时间为 60min，分析了 10批湿生扁蕾药材的 HPLC指纹图谱。结果:在选定的色谱条件下通过相似度分析确定10个色谱峰构成湿生扁蕾药材指纹图谱的特征峰。结论:采用 RP-HPLC所建立的指纹图谱具有稳定、重复性好的特点，可用于湿生扁蕾药材的质量控制。关键词: 湿生扁蕾； 指纹图谱；反相高效液相色谱法湿生扁蕾为龙胆科植物Gentianopsis paludosa（Munro）Ma.的干燥全草，藏药名为机合斗。分布于甘肃西南部、青海东部、四川北部及西藏等地区。湿生扁蕾全草主要含有1,7二羟基-3,8-二甲氧基等口 山 酮类、木犀草素等黄酮类、齐墩果酸等三萜类化合物。此外，还含还原糖、氨基酸、酚类、有机酸等1-3。湿生扁蕾具有清热解毒、利湿消黄、健脾止泻等功能，用于肝炎、胆囊炎、热病发斑、目赤肿痛、消化不良、肠胃炎等3。现代药理学研究表明，湿生扁蕾具有抗氧化、抗菌、护肝等多种药理活性4-5。但目前为止一直缺乏综合评价和分析湿生扁蕾药材品质的方法。中药材指纹图谱是近年来被国际公认的控制中药或天然药物质量的有效方法6-8，其优点在于可全面反映中药复杂的化学成分及其相对比例。本研究采用，建立了湿生扁蕾药材的指纹图谱，为的质量评价提供了依据。本文采用反相高效液相色谱法对湿生扁蕾药材指纹图谱进行了研究，为湿生扁蕾的药材鉴别、质量评价以及质量标准的制定提供依据。1 仪器与试药Agilent HP1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；AE-240电子天平（梅特勒-托利多仪器上海分公司）；KQ-100超声波清洗器（昆山市超声技术有限公司）；R-200旋转蒸发仪（瑞士布奇）。甲醇(色谱纯，天津市光复精细化工研究所)；磷酸（分析纯，白银良友化学试剂有限公司）；重蒸馏水（自制）；其它试剂均为分析纯。木犀草素对照品（购自中国药品生物制品检定所，批号111520-200201）。湿生扁蕾药材采自甘肃、青海10个不同地区，均来源于龙胆科扁蕾属植物湿生扁蕾Gentianopsis paludosa（Munro）Ma.的干燥全草，由甘肃省药品检验所宋平顺主任药师对以上品种进行鉴定。(湿生扁蕾具体产地见表1)。表1 甘肃、青海不同地区湿生扁蕾药材编号 1 2 3 4 5产地 合作 玛曲 临潭 湟中 湟源 编号 6 7 8 9 10产地 青海湖 卓尼 海晏 碌曲 夏河 2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱ZORBAX SB-C18(250 mm4.6 mm，5 m)；柱温30 ；流速1 mL/min； 进样量10L；检测波长260 nm；流动相甲醇（A）-0.4%磷酸水溶液（B）梯度洗脱（015 min，A:B=35:65，1560 min，A:B=60:40)；记录时间为60min。2.2 供试品溶液的制备 精密称取不同产地湿生扁蕾药材的干燥粉末（60目）1.0 g，置于 50 mL量瓶中，加入70%乙醇水溶液 40 mL，超声（33kHz，250W）提取30min，放冷，用70%乙醇定容至50 mL，0.45 m微孔滤膜滤过，滤液作为供试品溶液。2.3方法学考察2.3.1精密度试验 取同一批药材，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样5次，每次10L，测定其HPLC图谱。选出10个共有指纹峰进行考察，以7号峰为参照峰，结果表明各共有峰相对保留时间的RSD均小于2%，相对峰面积的RSD均小于3 %，表明仪器精密度良好。2.3.2重复性试验 取同一批药材5份，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分别进样10L，测得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于2 %，相对峰面积的RSD均小于4 %，结果表明本试验方法的重复性良好。2.3.3稳定性试验 取同一批药材，按2.2项下方法制备供试品溶液，按 2.1项下色谱条件分别在 0，4，8，12，24 h进样，每次10L，得各共有峰的相对保留时间的RSD均小于2% ，相对峰面积的RSD均小于5 %，表明样品溶液在 24 h内稳定。2.4指纹图谱及各项技术参数2.4.1样品指纹图谱及共有峰的标定 按上述液相色谱条件检测不同产地 10批湿生扁蕾药材的指纹图谱，分别将 10批湿生扁蕾药材的指纹图谱输入国家药典委员会开发的中药指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A )中，进行时间窗的设定、谱峰匹配，最后确定湿生扁蕾色谱图中含有9个共有色谱峰，见图 1、图 2。图1 湿生扁蕾药材的HPLC色谱图图2 10批湿生扁蕾 HPLC指纹图谱2.4.2共有峰相对保留时间及相对峰面积的比较 将10批样品的指纹图谱数据输入国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)中，进行数据处理。其中7号峰面积较大，且较稳定，选择7号峰作为参照峰 ，各峰相对保留时间、相对峰面积结果分别见表 5和表 6。表 5 10批湿生扁蕾药材共有峰相对保留时间s1s2s3s4s5s6s7s8s9s1010.0620.0620.0620.0620.06120.0620.0620.0620.0620.06220.1630.1700.1630.1640.1710.1710.1640.1710.1710.16530.2430.2430.2440.2450.2450.2450.2450.2460.2470.24540.4670.4670.4670.4670.4670.4680.4670.4670.4680.4685 0.4790.4790.4790.4790.4790.4790.4790.4790.4790.47960.484 0.4840.4840.4850.4850.4850.4850.4850.4850.48570.5050.5060.5060.5060.5090.5060.5060.5090.5070.5098111111111191.2001.2061.2061.2101.2101.2091.2101.2121.2111.216101.2551.2611.2601.2661.2661.26661.2641.2681.2701.270表6 10批湿生扁蕾药材共有峰相对峰面积 s1 s2 s3 s4 s5 s6 s7 s8 s9 s1010.0200.0320.0220.0170.0370.0190.0230.0180.035 0.06120.1030.0710.1000.0950.0700.0780.1030.0600.070 0.08830.1200.1400.1960.1080.0860.1000.1440.0740.087 0.04840.0840.0600.0850.0470.0560.0240.0820.0250.047 0.0485 0.0850.0550.1210.0800.0360.0470.1240.0500.0390.03660.1500.0630.2270.1080.0410.0690.1730.0740.049 0.05270.1550.1190.2990.2020.0910.1350.2320.1560.037 0.076811111111 1 190.3420.0680.0220.0730.0950.0470.0780.070 0.079 0.134 100.1420.2120.0370.2120.2610.2190.1300.210 0.280 0.237 2.4.3 指纹图谱相似度计算将 10批湿生扁蕾样品指纹图谱的 AIA数据文件导入2004年国家药典委员会开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱 R的相似度，结果见表7。表710批湿生扁蕾药材相似度分析结果样 品 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10相似度 0.946 0.951 0.933 0.917 0.909 0.921 0.941 0.985 0.964 0.9583讨论3.1提取方法的选择 通过对超声、热回流提取方式的考察，发现超声与热回流提取其色谱图中成分数量和含量相当。对甲醇、50%甲醇水溶液、无水乙醇、50%乙醇水溶液不同提取溶剂的考察，结果表明70%乙醇提取物色谱图信息量最多，成分含量最高。对不同提取时间 10、20、30、40、50、60 min 进行了考察，发现50%乙醇超声30min，成分数量及含量最高。故供试品溶液的制备方法确定为以70%乙醇为提取溶剂，超声提取 30min。3.2色谱条件的选择 分别用乙腈-水、甲醇-水、甲醇-磷酸水溶液为流动相，以不同梯度进行试验，结果表明甲醇-磷酸水线性梯度洗脱效果最好。同时采用 Waters二级管阵列检测器对检测波长进行了选择，通过比较254、260、270 和280 nm检测波长下的色谱图，发现检测波长为 260nm时，色谱图所包含的信息量最大、成分含量高，且各色谱峰分离较好，基线平稳。3.3指纹图谱的评价 在中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)的辅助下，得出了决明子药材的 HPLC色谱指纹图谱的对照指纹图谱，为决明子药材提供了质量上的技术监控手段。比较 10批决明子饮片样品指纹图谱后发现，收集来的不同产地决明子饮片指纹图谱中主要峰群的整体图貌基本一致，相似度计算结果表明，10批样品指纹图谱相似度均在 90%以上。虽然不同产地样品中各成分含量的相对比值有所差别，但这种在共性特征基础上存在的个体差异是常见的现象 ,因为药材生产过程中受到土壤、气候等因素、环境因素及采收加工过程中很多因素的影响，通过量化比较可以为选购原料药材及指导 GAP提供质量信息。指纹图谱是目前控制中药材质量最有效、最直观的手段之一。本文采用 RP-HPLC方法，建立了湿生扁蕾药材的指纹图谱。结果表明该方法稳定、可靠、重现性好，可为湿生扁蕾药材质量分析、评价与控制提供依据。参考文献:1 李作平，霍长虹，郑小莉.扁蕾的化学成分研究J.中国现代应用药学杂志，2003，20（1）:24. 2 米琴，曹长年，赵宙光，等.藏药湿生扁蕾有效成分的研究J.青海师范大学学报（自然科学版），2005，23（2）:64.3 王焕弟，谭成玉，杜昱光，等.藏药湿生扁蕾的化学成分研究J.中国药学杂志，2005，40（14）:1059.4 王焕弟，谭成玉，白雪芳，等.藏药湿生扁蕾有效成分抑菌作用初探J.天然产物研究与开发，2005，17（5）:598.