处理加热过的肌肉蛋白质来识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确定.ppt

通过单克隆抗体技术处理加热过的肌肉蛋白质来识别肉的种类以及加热肉品终点温度的确定 Y H P Hsieh F C Chen 和N djurdjevicAuburnAuburnAlabana36849 肉制品的质量和安全已引起消费者以及管理机构的广泛关注 在生肉制品质量控制 加强食物安全和分类管理方面酶连免疫吸附技术 ELISA 被认为是一种十分有效和适合的检测分析方法 为了定量的确定加热产品中搀杂肉的全部种类 在ELAISA技术中 许多单抗体已经被逐渐探索应用 在作用于加热处理过的肌肉蛋白质的过程中 单抗体技术已经得到发展 随着加热终点温度的增ELISA反应的程度也随之增加 可以用MABS 单克隆抗体技术 来检测肉品中特定的肉种类 因此 MABS可以用作决定预煮肉品的最大内部加热温度 以此来确保产品的安全性 在本节中主要介绍了现行的技术和实验操作过程 特点以及MABS的应用 1 介绍 因为经济的损失 食物过敏及宗教信仰方面的因素 肉品中搀杂不明肉类在很大程度上欺骗了消费者 联邦法律要求肉制品必须贴上标签以证明包含肉的种类 在许多国家已报道了肉类替代现象 例如在英国马肉被用作牛肉羊肉 马肉和袋鼠肉在加拿大发现被用作出口的牛肉 猪肉被用作牛肉和羊肉出口到中东地区 随着食品企业中机械去骨肉使用量的增加 最近 人们已越发的关注多种加工过程和预煮 肉类以及分割肉产品 美国农业部食品安全和检测服务局 USDFA FSIS 的管理条例中对使用机械分割肉做了如下的规定 只要求使用一类肉的肉制品中不要包含任何别的种类的机械分割肉 然而 由于不正当的交易和全国性经济欺骗现象的存在 国内零售市场中在鱼及陆生动物肉类产品中混入不知名的杂肉已成为一种普遍现象 研究表明煮制品比原料制品存在更高的搀杂现象 在一种产品中加入多种不知名的肉类也是一个十分普遍的现象 肉类应被煮制足够的时间 有利于人类的消化吸收 也可以确保消灭其中的病原微生物 在食用鲜肉和禽类制品时不正当的烹调被认为是引起传染疾病的一个主要因素 USDA FSIS已特别规定肉制品加热过程的指导方针 对于每种肉应有多种预煮制品 例如 未干制的禽类制品中心温度必须加热到71 1 而干制的禽类制品也必须加热到68 3 来杀死沙门氏菌 为了确保消除大肠杆菌O157 烤牛肉的PH值 应控制在7左右加热温度 68 3 别的制品PH值为7 加热温度为71 7 鲜猪肉加热时内部温度应达到76 7 而且杀死旋毛虫温度应至少比此温度再高17 然而 一旦肉品中搀杂了别的不知名肉类 由于不知名肉类的存在对于特定种类的最低内部加热温度也就失效了 为了阻止肉类的搀杂和减少由于不足够加热过程引起的食物传染疾病的危害 对于管理监督部门来讲 采用可靠分析方法来执行肉类管理程序是十分必要的 最理想的方法具有特定 反应灵敏 快速 经济性 高检测率的特点 并且能够提供量性的结果 尽管在每一种条件下单一的方法并不一定能够满足所有的要求 但选择ELISA用于肉类的检测可以满足最多的要求 多克隆抗 PABS 和单克隆抗体 MABS 技术都已用在ELISA中 MABS比PABS有更多的优点 连续使用 稳定的特性和免疫试剂相近性 在免疫分析中使用MABS可以提供独一无二的试剂 并且可以减少分析 的费用 MABS已被用在原料肉种类的鉴定 因为作用于正常状态下蛋白质的抗体在大多情况下不能识别加热处理后肉中的蛋白质 实验室中使用MABS来检测加热肉品中搀杂的肉的种类 在全部加热处理过的肉品混合物中MABS可以对目标品种的含量就行定量检测 而且可以决定预煮肉的最大中心加热温度 我们主要讨论MABS的实验操作过程特性和它的应用 在本章中也对这两种领域内的现行方法进行了大概的评价 2搀杂肉品种类的确认 2 1非免疫学方法 在过去的二十年中 许多用于确认肉品种类的非免疫方法例如电泳和色谱层析已经有了很大的发展 对于蛋白质的分离电泳技术是十分有效的 不同的肌肉蛋白质的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 经常产生相同的蛋白类型 所以在肉种类确认方面它的可信度十分的小 等吸附技术基于蛋白质不同的等电点可以把蛋白质依据不同种类而分开 这种技术被广泛用于确认 鱼肉的种类 也可以用于区分不同种类的原料肉 但是 当混合肉中存在多种肉或蛋白添加剂时 很难解释其检测结果 色谱法如气相色谱 液体色谱和高精度色谱已经被广泛用于肉种类的确认 这种方法是基于对肉样中脂肪酸成分 组氨基酸或蛋白质形状的检验来实现的 这些方法可以区分不同个体肉的种类 但是由于色谱类型复杂度的增加 这些方法在检测复合肉品中掺杂肉的种类时会失效 随着分子生物学技术的高速发展 包括 DNA杂交技术 聚合酶链反应和碎片分析技术已对法医学产生了革命性的变革 对于食品科学也是如此 DNA杂交技术已被用于多中肉类品种的确认 下一步准备也进行基因组DNA或克隆DNA同目标DNA的杂交 同时用颜色或自行x射线照相技术进行检测工作 这些方法在用于煮制肉类品种确认方面是独特的并且十分有用 但是在确认联系密切肉类时效果不好下一步准备显示牛 绵羊 山羊 基因组DNA水平上的相互交叉反应 通过混合未标记DNA修饰DNA杂交可以减少交叉反应 从而可以从交叉杂交种类中区分绵羊和山羊 大约有10 的区别限度 绵羊和山羊肉类的区分是使用直接连续技术来对比核苷酸的次序而实现的 同时也分析了限制核苷酸内切酶聚合酶链反应的产物 由于费用高和操作的复杂性 这些基于DNA水平的技术未被常规分析方法所采纳 2 2免疫学方法 免疫学方法是基于特定抗体 抗原反应 它适用于分析复杂混合物中的成分 同时此成分有最低的检测量 从本世纪开始 免疫技术已被用于动物肉类品种的确认 免疫技术的先进之处在于它可以在很大程度是提高检测的敏感性和结果的准确性 沉淀环实验是免疫分析方法的一个简单形式 它的原理是在实验管中抗血清和肉的抗原相汇处可产生可 见的环 血凝抑制实验是基于阻止抗原血清和它的同类抗原之间积极的反应 而此同种类抗原被同种外来羊的红血细胞所包裹 琼脂胶体免疫扩散 双层免疫扩散技术起源于Ouchyeriony 1948 的描述 同时也涉及抗血清和抗原在半固体琼脂胶体中的扩散 经过隔夜培养后在抗体和它对应的抗原相汇处形成一个可见的不透光的带 USDA FSIS肉类检查员对这种技术做了一定的修缮 使用标定的试剂纸片和提前准备的琼脂平板使此种 技术在检测原料肉的种类时更加便利 由于琼脂凝胶免疫扩散实验灵敏性易变化 培养的时间长 并且非肉的成分干扰大 所以限制了它在完整鲜肉分析中的应用 免疫分析经常用在临床处置中 但是一项研究指出 用I标记免疫试剂检测出牛肉中存在5 的其他成分 由于放射免疫分析技术要用有害的放射材料 并且要用闪烁计数器 所以限制了它在日常检验和检测肉种类中的应用 ELISA由于下面的优点而在肉种类 的确认中得到了十分广泛的应用 不用太贵的科学仪器 易于操作 免疫试剂用量小 可应用于大数量 宽领域的检测 经常应用的有三种类型 间接ELISA竞争 ELISA 夹心ELISA 间接ELISA 先把抗原吸入一个微量平板上 之后相反动物的抗体与抗原结合吸附在固体层上 通过二者与随后加入的反免疫球蛋白的结合 通过外来添加酶而形成的颜色 它可以检测到抗原与抗体的结合物 竞争ELISA技术是基于提取样品中有限的抗 体 而自由抗原和与固体相结合的抗原与抗体竞争相结合 固体相抗原结合的特定种类抗原的限制数同液体相中的抗原数成正比 夹心ELISA使用固体相上的抗体作为结合抗体 另一种抗体用作检测抗体 所以 这便形成了一个夹心 抗原位于中间 抗体在抗原分子的两侧 在表1中对不同类型ELISA用各种肉的抗原对原料肉的确认进行了总结 最近 单抗体技术也应用在ELISA中来对原料肉进行确认 ELISA也用于煮制肉品种类的确认中 2 3抗体的来源 在使用酶免疫测定来确认肉的种类成功的发展的过程中 最重要的是特定种类的抗体 不同种动物需要不同的免疫试剂 传统的来讲 在ELISA中应用的单抗体来自免疫动物的血清 多克隆抗体技术在自然界中是外源的 亚群和特定种类抗原或相反种类抗原相结合 因此可以十分容易的观测到血清和相关种类抗原的交叉反应 在检测程度标准化的发展过程中 一组抗体亲和力和结合 特性的变化也引起了人们的关注 同多克隆抗体技术相反 单克隆抗体技术的来源 单细胞链在自然界中是同源的 它们来自融化得抗体分泌物Blymphocytes 而这种分泌物又来自患有骨髓瘤的免疫老鼠 融化的产物叫杂交细胞 可以在培养基中生长 并且可以继续的分泌抗体 经过仔细的镜检和亚克隆后 可以挑选出稳定的杂交细胞链 它可以分泌出针对某一特定抗原的抗体 而且产生抗体十分频繁 采用单抗体的方法来对 肉的种类进行免疫分析时 应保证连续供应统一的免疫试剂 也应减少标准分析程序 2 4抗原的选择 大多数对于原料肉种类的免疫检测方法都采用多克隆方法来处理整个血清或血清蛋白 因为血清蛋白的存在可能是必须的 肌肉组织中残余的血浆成分会发生变化 那么便意味着肌肉组织的存在 进而可以得出结论 用这些多克隆技术来定量的估计搀杂物的量是不可靠的 肌肉蛋白质的存在是显著的 预示了鸡肉 组织存在的可能性比血清蛋白存在的可能性要大 对于肉种类的多克隆技术已用于可溶性粗蛋白的分析中或净化肌肉成分 例如肌钙蛋白和肌红蛋白 这些检测方法的优点在于容易获得提取样品 更重要的一点在于对传统检测方法的改进与发展 不溶性肌肉蛋白如连接蛋白也可以用于单抗体的分析方法中 来确认原料禽肉的种类 然而不溶性蛋白的提取需要特殊的步骤 这些方法毫无疑问的可以应用于法律事件的检测中 但 不适用于常规检验分析或产地检验 因为通过加热处理后 大多的蛋白质变性并且成为不可溶的 所以使用抗体来处置本源蛋白质的方法不可以用于加热处理过的肉类 对于加热的肉类的确认也应用热稳定蛋白 在解决特定种类热稳定性组成方面已做了十分大的努力 用IEF方法 Jones和Mortiner 1985 说明了来自肾上腺和肌肉组织的BE抗原蛋白具有热稳定性 但是不同类型BE抗原的特性是显著不同的 Sherikar使用SDS 聚 丙稀酰胺凝胶电泳的方法检测了不同种类的BE抗原 并且得出结论在BE蛋白中肌钙蛋白T属于特定种类蛋白部分 没有经过加热处理的从肌肉组织中分离的具有抗热性的糖蛋白应用于多克隆抗体技术中 这些抗体已应用于夹心ELISA中用于鉴别加热和罐装肉类食物中 这些方法在商业检测中是十分有效的 并且也应用于USDA对加热肉品种类确认的调查中 大多对于加热肉品种类的确认中大都使用多克隆抗体技术方法 最近在 我们实验室中对单克隆抗体技术确认加热肉种类的研究中也取得了一定的进展 用于加热处理肉类蛋白鉴别的单克隆抗体技术也可用于原料肉的鉴别中 因为在准备检测样品时这些原料肉可以十分容易的被加热处理 3单克隆抗体技术用于加热处理肌肉蛋白的确认3 1单克隆抗体介绍 用于热稳定性或抗热性蛋白的不同抗原已经用于发展抗体技术来确认加热肉品的种类 热稳定性这一个词在字典中被十分清晰的定义 大多情况下 它指经过加热处理的肉类浸提物中保持可溶性和抗原性的完整蛋白或蛋白碎片 如果一种特定分析蛋白已知应用于一种特定的种类确认 那么在免疫分析技术中 使用提纯蛋白可以增加对于特定种类抗原决定基的免疫反应机会 然而对于杂交瘤的分泌物并不一定完全需要提纯蛋白作为抗原 由于在挑选适宜特定种类蛋白主要方面缺少足够多的知识技术 所以在单克隆抗体技术中我们使用加热处理过的可溶性粗肌肉蛋白作为免疫源 在加热之后 纯的肉类蛋白质显著减少 这样在提取物中只有热稳定性或热抗性的部分蛋白质仍保持可溶性 对期望的特性应用MABS 单克隆抗体技术 检测 时应选择杂交克隆分泌物 而且必须要经过仔细的镜检和亚克隆 对于准备抗原有两种方法 1 用蒸馏水或盐水对粗瘦肉进行搅拌 过滤物可以作为免疫原 2 瘦肉混于0 15MNACL中 沸水加热并且离心 上层液121 30分钟高温灭菌过滤 用90 乙醇进行萃取 沉淀 干燥物溶于盐溶液中备用 来自免疫老鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后可作为杂交产物 在我们的实验室中 遵守由Kohler和Milstern描述的一般程序 那便是在随后 的步骤中要进行必要的修饰 ELISA镜检是用于经过选择实验的与抗原对应的克隆体 同时用异种的浸提物和别的食物蛋白通过交叉反应来稳定杂交物 杂交产物具有我们所期望的特性 之后通过限定性稀释程序对之克隆至少两次以获得稳定的单克隆细胞链 SDS PAGE和免疫点技术用于确认每种单克隆肉类浸提物种抗原的成分 3 2单克隆抗体的特点 目前为止 五种免疫球蛋白单克隆抗体技术在实验中已用于掺杂肉种类的检测 单克隆抗体2F8同五种经过加热的哺乳动物肉发生十分强烈的反应 但不同任何加热的禽肉发生反应 3E12同禽肉反应 5D2主要用于鸡和火鸡的鉴别中 9C6只特定于鸡 5H9只用于猪肉 第一组四种单克隆抗体技术用于经水或盐水浸提过的经过加热处理的肌肉蛋白 它们同 特别的加热肉提取物发生了强烈的反应 但不同原料肉和加热处理后的肉相作用 免疫印迹结果表明所有的单克隆抗体同加热处理肉提取物中两条或更多条蛋白带发生反应 除了5H9以外 但它可检测猪肉浸提物中单一带 5H9也同原料猪肉浸提物的三个蛋白带发生反应 带有24KD的蛋白质可以被确认为猪肉特定的热稳定肌肉蛋白 所有的单克隆抗体也发展成对骨骼肌具有特定的反应 表3说明了5H9对于不同猪肉组织和食物蛋白的免疫反应 也同时说明了5D2的特性反应 这些单克隆抗体对于特定骨骼肌而具有的特点不同于别的已报道的结果 别的报道讲已观察到这些抗体对器官 心肌 或平滑肌的交叉反应 基于特定肌肉的单克隆抗体分析可以对样品中瘦肉进行定量分析检测 对于定量分析来讲抗原均匀的分布在不同动物的半天肌肉组织中是十分 重要的 所以抗原的量决定于同样品中一定目标肌肉组织的分析反应 而不用考虑肌肉切面的位置 单克隆抗体5H9用于定量检测牛肉制品中不同切面的猪肉含量 无论是使用间接非竞争还是竞争性ELISA技术 都表示在肉不同的切面整个浸提物蛋白浓度和猪肌肉组织得测定数量水平没有不同 这些结果暗示 由单克隆抗体5H9所检测得抗原组成对于制造商十分的适用 它可用于定量检测肉样中猪瘦肉 表4确认加热肉种类时作用于加热处理蛋白质的单克隆抗体的鉴别特性 3 3掺杂肉类的检测 如表5所示 间接ELISA反应的吸光度或者竞争性ELISA反应所表达的抑制百分率和牛肉中猪肉的百分量对数之间存在线形关系 表6所展示的是使用间接和竞争ELISA应用单克隆抗体5D2来定量检测猪肉中鸡肉含量的药剂反应水平曲线 应用间接和竞争性ELISA系统来检测我们的单克隆抗体可以得到一致的结果 说明这些单克隆抗体在肉制品的快速检测或者掺杂肉种类的确认方面是十分有效的 检样掺杂违规程度的判断受限于分析方法所能达到的最低检测水平 应用传统的琼脂胶体检测方法 它的最低检测量通常在5 10 ELISA的应用已经提高了检测能力 但不能检测肉样中含量十分低的掺杂肉类 采用了我们的分析程序 这些分析方法对于掺杂种类含量的检测能力在0 5 1 之间 可以同大多的已报道的用于肉种类确认的ELISA方法相比 对于实际应用来讲 掺杂肉1 的检测能力对于官方的常规分析检测已足够 现在确认肉种类的商业ELISA方法一次只能对单一的种类进行定量检测 如果把之应用到管理当中 使用这些ELISA方法来检测大量样品中复杂的肉种类是十分费时的而且花费十分大 如果用单一检测方法来区分不同肉的种类会更昂贵更费力 例如应用单克隆抗体2F8来检测加热家禽肉制品中普通的哺乳动物肉的种类 应用单克隆抗体3E12对加热的牛肉或猪肉中的禽肉进行单一检测 为了进一步的确认 从最初的检测中得到 的明确的样品 接下来可以用单种类的分析方法进行来确认存在的特定种类 3 4未来的发展 单种类的单克隆抗体技术的发展比多种类的发展更难 主要因为对于特定种类抗原确认所检测的天然蛋白抗原比动物学相关种类的检测蛋白抗原更稀少 对于包括特定种类抗体的肌肉蛋白的确认可以为单种类单克隆抗体的有效产物提供有价值的信息 猪类中24kd热稳定肌肉蛋白的发现可以促进单一体的应用 来确认特定种类肌肉蛋白同别的种类相似 或一致 对于恢复多种类的抗原有很多影响因素 例如PH值 盐含量 加热方法 而且为了获得准确的定量结果也应对基质进行仔细的研究 与此同时也应大力推进基于单一体的传感和别的免疫测定方法和发展 例如用一步分析可以用于确认搀杂的水平 4加热终点温度的确认4 1非免疫方法 美国农业部使用基于减少蛋白溶解性或是酶活性的各种方法来验证肉制品是否加热到所需的最低终点温度 依据产物的类型和所需的终点加热温度来选择使用的方法 现行的方法包括凝结实验 作用于加热温度低于65 的牛肉和猪肉产品 酸性磷酸盐反应方法作用于灌装汉堡 后蝤肉和午餐肉 牛过氧化氢酶实验作用于数量十分少的烘烤和加热牛肉 但这些方法自身由于其经验主义和主观主义而受到批评 在提高现有方法方面已做了十分多的尝试而且已形成了新的方法可以更准确的确定加热终点温度 许多技术 例如电泳法 色谱法 微分扫描测热计以及近红外线光谱法也在尝试着应用在加热终点温度确定过程中 大部分这些方法主要的影响因素是解释实验结果的困难性 加热终点温度相对精确的估计 并且需要高尖的设备 操作人员要进行培训 Callins等认为乳酸脱氢酶在猪肉和牛肉加热终点温度确定中可作为分析检测指标 因为酶的活性同加热中终点温度和搀杂肉的加热终点温度呈反比例的关系 另外 许多方法对内源酶的剩余放射性进行检测 如磷酸激酶 丙酮酸激酶 转氨酶 氨基葡糖酶和磷酸丙糖异构酶 同时这些检测方法也被推荐用于准确的控制肉制品的加热过程 4 2免疫方法4 2 1乳酸脱氢酶的抗体 禽类制品所需的加热终点温度 火鸡胸脯肉足够加热过程的指标建议是乳酸替代了检测酶活性ELISA应用单克隆和多克隆抗体检测本源乳酸脱氢酶的方法已运用到定量测定减少酶的浓度 进而可以确定火鸡和牛肉制品的终点加热温度 这个方法可以区分1 以下和71 1 以上加工的火鸡胸脯肉的乳酸脱氢酶的浓度 这正是非干制脱氢酶 它最合理 的浓度为0 3 kg肉 其结果不受盐含量 产品包装尺寸 烟熏时间表或是加热过程之前肉经过冷冻贮藏的影响 然而 这种方法在区分加热68 9 和71 1 火鸡大腿肉时效果不好 因为在鸡胸脯和大腿肉中存在的酶有不同的热稳定性 因为肌肉类型和贮存条件会影响个体酶的数量和稳定性 所以大多方法会在使用时遇到困难 这些方法基于 特殊酶的浓度或活性来实现的 而分布在肌肉组织中个体酶时变化的 4 2肌肉蛋白质的单克隆抗体 基于监控平均分布的肌肉蛋白质反应的方法 可以更好的确定加热终点温度 同加热肉品反应的单克隆抗体指示在不同温度下同加热肉品产生的不同反应 这一观察结果暗示了使用单克隆抗体来检测肌肉蛋白质热变性而作为肉制品足够加热过程的指示指标的潜在性 因为在此方法中使用的MABS便是为了应用于加热处理的肌肉蛋白质 我们应用 ELISA技术分别使用单克隆抗体2f8和单克隆抗体5d2来研究不同内部加热温度的牛肉和鸡肉 如表7所示 当样品加热到60 或更低时和可溶牛肉蛋白质浸提物相结合的单克隆抗体2f8是十分少的 当加热温度从60 升到66 时ELISA反应只有轻微的增强 在表7a可以看到牛肉加热在60 66 和80 之间时免疫方法显著的增加 在60 66 范围内ELISA反应和加热样品温度是线形 关系 从而这种方法可以预测加热牛肉的加热终点温度并且在样品中有95 的可信度 误差为 1 在加热鸡胸脯肉中也观测到了单克隆抗体5D2的相同对应温度但同之呈线性系的温度范围为60 74 同一定酶或蛋白