细胞生物学实验报告1-动物细胞融合.doc

【实验目的】1. 了解动物细胞融合的常用方法2. 学习化学融合和电融合的基本操作3. 观察动物细胞融合过程中的行为和变化【实验原理】1. 病毒诱导融合仙台病毒、牛痘病毒、新城鸡瘟病毒和疱疹病毒等可以介导细胞的融合。这类病毒的被膜中含有融合蛋白，可以介导病毒同宿主细胞融合，也可以介导细胞与细胞的融合。用紫外线灭活后，这些病毒即可诱导细胞发生融合。2. 化学诱导融合很多化学试剂都能诱导细胞融合，如聚乙二醇（PEG），二甲基亚砜、山梨醇、甘油、溶血性卵磷脂，磷脂酰丝氨酸等。这些物质能够改变细胞膜脂质分子的排列，在去除这些物质之后，细胞膜趋向于恢复原有的有序结构。在恢复的过程中相接处的细胞由于接口处脂质双分子层的相互亲和与表面张力，细胞膜融合，胞质流通，发生融合。化学诱导方法，操作方便，诱导融合的概率比较高，效果稳定，适用于动、植物细胞，但对细胞具有一定的毒性。PEG是被广泛使用的化学融合剂。3. 电击诱导融合包括电诱导、激光诱导等。其中，电诱导是先使细胞在电场中极化成为偶极子，沿电力线排布成串，再利用高强度、短时程的电脉冲击破细胞膜，细胞膜的脂质分子发生重排，由于表面张力作用，两细胞发生融合。电诱导方法具有融合过程易控制，融合概率高，作用机制明确，可重复性高等优点。【实验材料】1. 材料 鸡血红细胞2. 试剂 50%PEG、0.85%氯化钠溶液、GKN缓冲溶液3. 器材 倒置显微镜、离心机、量筒、注射器、载玻片、盖玻片、离心管等【实验步骤】1. 取离心管，加入冷藏的鸡血1ml，加入4ml 0.85%氯化钠溶液，摇匀2. 将离心管放入离心机中，以1000-1200r/min的速度离心5分钟左右。取出离心管，弃掉上清液，再加入4ml氯化钠溶液，重复以上操作。3. 取离心管，弃掉上清液后，按照红细胞沉积的体积，加入1-2mlGKN溶液，摇匀。4. 取以上溶液1ml，加入3mlGKN溶液，再次摇匀5. 取以上溶液1ml，加入0.5mlPEG，先静置1-2min，再将溶液摇匀后，静置1-2min。6. 用滴管取溶液制成涂片，置于显微镜下观察。【实验结果】最初，在显微镜下观察到的细胞如下二图所示。其中，第二图中指针所指的两细胞紧贴在一起，有相互融合的趋势。由于在第二步稀释的过程中未充分振荡，使得许多细胞都聚集在一起成堆，影响了细胞的观察。因此，我又重新充分稀释并振荡了细胞悬液，并重新制备了涂片，所得的新影响如下图：在上图中，可以明显看出箭头所指的两细胞中间的细胞膜已经消失。有着明显的融合的现象了。【实验结果分析与注意事项】本次试验最终观察到了明显的细胞融合，可以说较为成功。其中重新稀释振荡细胞悬液并重置涂片，使得能够看到明显的细胞融合现象。而其他实验组也出现了类似情况，都是细胞悬液稀释程度不够，制成的图片在显微镜下呈现大块的细胞堆积，难以观察到明显而清晰的单个细胞，更不用说两个细胞的融合了。因此在本次试验中，第一个注意事项便是充分地稀释和振荡摇匀细胞悬液，达到试验的细胞浓度要求（17000个/毫升左右）。许多实验组由于在制备的第五步（滴入PEG）过程中，滴入PEG后立刻摇匀了细胞悬液，并没有让PEG沉降到细胞悬液底部后，在保持高浓度的情况下与接触面的细胞充分反应，使得所观察到了细胞融合率不高，观察效果不明显。因此，让PEG与细胞悬液分层静置足够的时间也是十分重要的。另外，包括我组在内的许多实验组在观察细胞是发现目标细胞总是在不规则移动，十分影响细胞的观察。根据指导老师的说法，这是由于涂片的悬液量太多导致细胞在悬液内流动所致。因此，在制片时，适当的悬液量是需要注意的。不能过多，当然也不能过少。附：细胞融合技术的应用1. 单克隆抗体动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨蛋白质的精细结构；淋巴细胞亚群的表面新抗原；组织相容性抗原；激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；肿瘤的定位和分类；纯化微生物和寄生虫抗原；免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法 (“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。2. 植物细胞融合育种植物细胞融合可分为体细胞杂交和配子-体细胞杂交，前者是指不经过有性生殖，而直接由体细胞原生质体融合产生杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程，后者是指性细胞原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支，是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂交的新途径。自1960年Cocking用酶解法分离出番茄根原生质体后，Nataga和Takebe1970年首次利用烟草叶分离出原生质体，经培养获得再生植株；1975年以色列的Vardi等首次从木本植物shamonti甜橙珠心组织诱导胚愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体，经培养通过胚状体再生出植株；在禾本科植物中，除灾珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料，较早获得原生质体再生植株外，直到1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株，才出现了重大突破。现在已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂交细胞系或杂种植物。随着多种细胞原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。目前已经成功得到的融合植株有甘蓝-青菜、大豆-马塘草、矮牵牛-龙面花、大麦-