底物抑制剂辅助胰蛋白酶复性.doc

K016底物抑制剂辅助胰蛋白酶复性黄星马帅耒闫明刘铮（清华大学化学工程系，北京 100084）摘 要 酶可以与底物或者底物抑制剂特异性结合，由诱导契合(induced-fit)理论可知，酶蛋白与底物结合并不是底物与活性部位的密切互补匹配，而是在底物诱导下酶分子发生一定程度的构象变化，与底物发生互补契合。这启发我们考虑利用底物或者底物抑制剂来诱导蛋白质活性部位正确结构的形成，实现蛋白质体外复性。本研究旨在以 trypsin（胰蛋白酶）为模型蛋白质，以benzamidine（苯甲脒）为底物抑制剂，考察 benzamidine 对天然 trypsin 活性的影响，优化 trypsin复性。首先，考察了底物抑制剂 benzamidine 对 trypsin 非还原、还原变性的影响。实验表明，非还原条件下，benzamidine 有维持天然 trypsin 活力的作用。但在还原变性时，则没有这种作用，说明二硫建在维持 trypsin 正确的三维结构中起着更为重要的作用。进而，用 8M 尿素和 30mM DTT对 trypsin 进行了还原变性，考察了 benzamidine 浓度对 trypsin 复性的影响，发现二者的摩尔分子数比大于 250 后，benzamidine 对 trypsin 产生明显的活性抑制作用，因此在复性操作中应将此分子数比控制在小于 250 的范围内。实验还确定了复性的最佳 pH 为 7.0，氧化还原试剂 GSSG 和GSH 均为 1mM。最后，尝试了用固定了 benzamidine 的凝胶辅助 tyrpsin 复性。在逐步降低尿素浓度的同时使变性 trypsin 逐步复性，并吸附到凝胶上，复性结束后，对 trypsin 进行洗脱、分离，发现固定化的 benzamidine 有更好的复性效果，表明可实现 trypsin 的复性与分离耦合。关键词 蛋白质复性 抑制剂 胰蛋白酶 苯甲脒 固定化引言重组蛋白质的复性过程中常会遇到蛋白质错误折叠与聚集问题，这些将导致蛋白质复性 率降低并使后续纯化过程变得复杂。依据对蛋白质体内折叠过程的认识，研究者们采用分子 伴侣类型的添加剂来辅助蛋白质结构的形成13。酶作为功能性蛋白质，可以与底物或者抑 制剂特异性结合，由诱导契合(induced-fit)理论可知4，在酶催化过程中，酶在底物诱导下发 生一定程度的立体形变而成为具有催化活性的构象。这启发我们考虑采用底物或者抑制剂来 诱导蛋白质活性部位结构的形成，从而实现变性蛋白质的体外折叠和复性。为考察上述设想的可行性，本文以胰蛋白酶（Trypsin）及其抑制剂苯甲脒（Benzamidine） 为研究体系，通过实验考察了 Benzamidine 辅助 Trypsin 复性过程的特性以及主要影响因素， 发现并证实 Benzamidine 具有诱导 Trypsin 活性结构形成的功能，采用固定化 Benzamidine 实现了 Trypsin 复性与纯化过程的耦合。本文实验结果证实了以抑制剂辅助蛋白质折叠这一 新复性方法的可行性，并显示出此方法特别适宜于那些在水溶液中易于发生自降解的蛋白质复性。11材料与方法1.1 实验试剂与设备主要试剂包括猪胰蛋白酶 Trypsin （Sigma, USA ），Benzamidine （Sigma, USA ）， N-Benzoyl-Phe-Val-Arg p-Nitroanilide Hydrochloride（Sigma, USA），N-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride（BAEE）（ICN，USA），二硫苏糖醇（DTT）（Bebco, USA），还原 型、氧化型谷胱甘肽（GSH, GSSG）（Roche, Switzerland），三羟基氨基甲烷（Tris）（Amersham, Sweden），尿素（Urea）（Merck, Germany）。吸光度的测定采用 6010 型紫外可见分光光度计（上海惠普）和 Spectra MAX190 型 酶标仪（Molecular Devices，USA）。1.2 胰蛋白酶的变性操作变性液（简称 DB）为 pH8.6, 0.10 molL-1 Tris-HCl 含 8.0 molL-1 Urea、0.020 molL-1 DTT 和 1.0 mmolL-1 EDTA。用变性液配置 50 mgml-1 的 Trypsin 溶液，37C 保温 3 h 使其彻底变 性，置于 4C 冰箱中备用。1.3 胰蛋白酶的复性操作复性操作在 4C 下进行，复性缓冲液（简称 RB）为 pH7.8, 0.10 molL-1Tris-HCl 含 1.0 mmolL-1 GSSG，1.0 mmolL-1 GSH 及 1.0 mmolL-1 EDTA。用该缓冲液配置所需浓度的 Benzamidine 用于复性，复性蛋白质溶液浓度为 0.50 mgml-1，4C 下保温 12 h 后测定酶的活 性。1.4 胰蛋白酶活性测定对天然胰蛋白酶进行稳定性分析时，采用 N-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride（BAEE）为底物，首先用 pH7.5, 0.050 molL-1 Tris-HCl 缓冲液配置 1.0 mmolL-1 底物溶液， 取 2.9 ml 底物溶液加入石英比色皿中，然后加入 100 l 胰蛋白酶溶液迅速混合，在 25C 条 件下，利用分光光度计测定反应液 253 nm 的吸光度，通过吸光度值的升高速率来计算胰蛋 白酶的活力。在进行复性蛋白测定活性时，采用特异性更强的 N-Benzoyl-Phe-Val-Arg p-Nitroanilide Hydrochloride 为底物，首先用 pH7.5，0.050 molL-1 Tris-HCl 缓冲液配置 1.0 mmolL-1 底物溶 液，先取 100 l 底物溶液加入 96 孔板中，然后加入 10 l 胰蛋白酶溶液，在 25C 条件下利 用酶标仪测定反应液 405 nm 的吸光度，通过吸光度值的升高速率来计算胰蛋白酶的活力。 本文采用比活力（Specific Activity）作为量化指标，其定义为：Specific Activity （Umg-1）= （O.D.405/min）/（0.001WE） 每分钟 405nm 吸光度的变化值，min-1 酶活测定时加入的酶的质量，mgO.D.405/minWE在进行 Trypsin 失活特性研究时，为更有效地区别不同操作条件下的稳定性，采用相对酶活力（Relative Activity）作为量化指标，其定义为如下：Relative Activity = （剩余酶比活力/初始酶比活力） 10021.5蛋白质浓度测定用吸光光度法，测定蛋白质溶液 280 nm 的吸光度。结果与讨论22.1 Benzamidine 对天然 Trypsin 的稳定性的影响天然 Trypsin 具有较强的自降解能力，且其水解反应受温度和溶液环境影响很大。对这一类蛋白质，如何抑制其自降解是确定其复性操作条件时必须考虑的一个重要因素。为此， 本文首先考察了天然 Trypsin 的稳定性及其影响因素，以作为选择确定其复性操作条件时的 参考。将天然 Trypsin 溶于复性液中，其终浓度定为 1.0 mgml-1，4C 放置 12 h 后测其催化 BAEE 活性，结果如图 1 所示，图中以 Benzamidine 与 Trypsin 的摩尔比作为其相对浓度。由图 1 可知，低浓度 Benzamidine 有助于 Trypsin 处于较高的活性状态，特别是当 Benzamidine 与 Trypsin 的分子比在 50 到 250 之间时，加入 Benzamidine 使得 Trypsin 的相对活力超过 100。这表明溶液中 Trypsin 在 Benzamidine 作用下构象发生了变化，使得其催化活性更高。 换言之，Benzamidine 具有诱导 Trypsin 活性结构形成的功能。而当 Benzamidine 与 Trypsin 的分子比大于 250 时，相对活力随 Benzamidine 浓度的增高而降低，此时，Benzamidine 对Trypsin 的抑制作用成为二者相互作用的主要方面且其随 Benzamidine 浓度的增高而强化。200160200160120RB-4oC12080400804000250 500 750 1000 1250n(Benz)/n(Trypsin)0510 15 20 25 30Time (h)Fig.1 Stability of trypsin as a function of the benzamidineFig.2 Stability of trypsin as a function of different bufferconcentrationcomposition分别将天然 Trypsin 溶于复性液、变性液以及含 1.0mmolL-1 Benzamidine 的变性液中，终浓度为 1.0 mgml-1，在 4C 保温，按时间间隔取样测定 Trypsin 的活性，结果如图 2 所示。 图中显示，与不加 Benamidine 的变性液中的结果相比，加入 Benzamidine 之后，能够在一 定时间范围内（本图中为 5h）减缓蛋白质失活，但随着时间的延长，Trypsin 的活性完全丧 失。这可能是由于还原剂 DTT 的持续作用使得 Trypsin 分子内的二硫键断开所致，换言之， Benzamidine 对于 DTT 作用下的二硫键断开反应是不具有抑制作用的。2.2Trypsin 复性过程研究2.2.1 稀释复性条件的优化（1）pH 对 Trypsin 复性的影响3Relative Activity (%)Relative Activity (%) o DB-4 CDB+Benz-4oC胰蛋白酶含 4 对二硫键，pH 是影响二硫键形成反应的重要参数5，为此首先测定了不同复性 pH 值时的复性率，结果如图 3 所示。由图可知，对于 Trypsin 而言，最优复性 pH 值 在 7.08.0 之间。（2）氧化还原电势组成对 Trypsin 复性的影响考察不同 GSH/GSSG (mmolL-1/ mmolL-1)下的复性率，结果如图 4 所示。从中可知，对Trypsin 复性的最佳氧化还原电势组成为 GSSG 与 GSH 均为 1.0 mmolL-1。2002502001501501001005050006.57.07.58.08.59.0RB pH10.0/1.0 1.0/0.1 2.0/1.0 1.0/0.2 1.0/1.0 2.0/0GSH(mmol.L-1)/GSSG(mmol.L-1)Fig.3 Refolding of trypsin as a function of pHFig.4 Refolding of trypsin as a function of redox potential2.2.2 Benzamidine 辅助 Trypsin 复性 根据图 2 所述的 Benzamidine 对 Trypsin 活性的影响，本节在其最适浓度范围内（用二者的摩尔比来表示）考察 Benzamidine 对 Trypsin 复性的影 响，结果如图 5 所示。从中可以看出，Benzamidine 的最佳用量为 Benzamidine 与 Trypsin 的 分子比为 10100，即当复性液中蛋白质中浓度为 0.50 mg ml-1 时，对应 Benzamidine 浓度约 为 0.202.0 mmolL-1。60050040030020010006005004003002001000ESGS ControlESGS ControlFig. 5 Refoldingof trypsin as functionoftheFig.6 Trypsin refolding using immobilized benzamidinebenzamidine concentration2.3 固定化 Benzamidine 辅助 Trypsin 复性and stepwise dilution以便于在复性完成之后方便地去除所使用过的各类辅助试剂，使复性蛋白质得以纯化并方便后续制剂过程，本文采用固定化 Benzamidine 来进行蛋白质复性，作为对比，实验中还采用不含 Benzamidine 的复性液进行直接稀释复性。 将固载 Benzamidine 的 Sepharose 6B 凝胶加入复性液，然后以 1.0 mLmin-1 的速率逐滴 加入变性蛋白质溶液，20C 下复性 2 h 后，离心取出凝胶部分（记为 GS），用洗脱液（pH8.0，0.050 molL-1 Tris-HCl 含 1.0 mmolL-1 EDTA, 1 molL-1 NaCl）洗脱后离心取其上清（记为 ES）， 测定活性。作为参照，同时采用分步稀释法向变性蛋白质溶液中流加复性液进行复性，保持二者的终蛋白浓度一致，测定其活性（记为 Control）。结果如图 6 所示：复性过程中吸附在4Specific Activity (U.mg-1)Specific Activity (U.mg-1)Specific Activity (U.mg-1)Specific Activity (U.mg-1)胶上后被洗脱下来的 ES 活力最高，GS 与 Control 都不高。说明固定有 Benzamidine 的凝胶可以辅助胰蛋白酶复性并提高复性活力。结论3本文依据酶催化的“诱导契合”机理提出采用抑制剂来辅助蛋白质复性的设想，以胰蛋白酶为模型蛋白质，首先考察了 pH、抑制剂、变性剂和温度等对天然 Trypsin 稳定性的影响， 结果表明复性操作宜在 pH 78 和低温下进行；Benzamidine 在低温下具有诱到 Trypsin 活性 结构形成的功能；但对于 DTT 导致的二硫键被破坏则不具备抑制作用。采用固定化 Benzamidine 进行 Trypsin