临床诊断试剂常见方法及原理.ppt

抗体 antibody 指机体的免疫系统在抗原刺激下 由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的 可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白 主要分布在血清中 也分布于组织液及外分泌液中 抗原 是指能够刺激机体产生 特异性 免疫应答 并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合 发生免疫效应 特异性反应 的物质 抗原的基本特性有两种 一是诱导免疫应答的能力 也就是免疫原性 二是与免疫应答的产物发生反应 也就是抗原性 检测特定的抗体是一种常见的医学诊断方式 而血清学方面的应用便依赖于此 以某种疾病的生化检查方法为例 可通过对血液中人类疱疹病毒第四型或者莱姆病抗体的滴定量来判断是否患病 如果被检测者的血液中没有发现这种抗体 则此人要么没有被感染 要么即使被感染也是很早以前的事情了 那些记忆B细胞都已消解殆尽了 在临床免疫学中 通过浊度测定法 或者比浊法 对各种免疫球蛋白的水平进行测定 以了解患者的抗体情况 对于肝脏发生损伤但尚未确诊的患者检查何种免疫球蛋白升高情况 有的时候有助于找出问题的原因 例如 IgA升高可能意味着酒精性肝硬化 IgM升高可能意味着病毒性肝炎或者原发性胆汁性肝硬化 IgG升高则可能是由肝硬化 病毒性肝炎或者自身免疫性肝炎的征兆 患有自身免疫性疾病的患者 通常会存在自身细胞抗原表位相结合的抗体 大部分患者可通过血液检查检测到 而通过抗体直接对红细胞的表面抗原进行抗人球蛋白测试 则可以确诊免疫所致的溶血性贫血 抗人球蛋白测试也用于输血之前的抗体筛查准备工作 以及产前孕妇的抗体筛查 在实践中 基于对抗原抗体复合物的免疫检测手段被用来诊断所感染的疾病 这些手段包括 酶联免疫吸附试验 免疫荧光染色法 西方墨点法 免疫扩散法 免疫电泳法以及磁性分离酶联免疫分析等 抗人绒毛膜促性腺激素抗体被用于非处方妊娠检测 如早孕试纸等 特定的单克隆抗体疗法被用于治疗诸如类风湿性关节炎 多发性硬化症 银屑病等疾病 此外 单克隆抗体还被用于治疗诸如非霍奇金氏淋巴瘤 大肠癌 头颈部癌以及乳腺癌等多种癌症 某些如X 联无丙种球蛋白血症以及低丙球蛋白血症 的免疫缺陷会导致部分甚至全部抗体的缺失 这种类型的疾病 通常是通过向病患注射包含抗体的人或动物血清 混合免疫球蛋白或者单克隆抗体等方式 建立短期的被动免疫力的手段进行治疗的 酶联免疫吸附试验 又称酵素免疫分析法 Enzyme linkedimmunosorbentassay 简称ELISA 利用抗原抗体之间专一性键结之特性 对检体进行检测 由于结合于固体承载物 一般为塑胶孔盘 上之抗原或抗体仍可具有免疫活性 因此设计其键结机制后 配合酵素呈色反应 即可显示特定抗原或抗体是否存在 并可利用呈色之深浅进行定量分析 根据待测样品与键结机制的不同 ELISA可设计出各种不同类型的检测方式 主要以三明治法 sandwich 间接法 indirect 以及竞争法 Competitive 三种为主 以下为各种方法之介绍 三明治法三明治法常用于检测大分子抗原 一般之操作步骤为 将具有专一性之抗体固著 coating 于塑胶孔盘上 完成后洗去多余抗体加入待测检体 检体中若含有待测之抗原则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结洗去多余待测检体 加入另一种对抗原专一之一次抗体 与待测抗原进行键结洗去多余未键结一次抗体 加入带有酵素之二次抗体 与一次抗体键结洗去多余未键结二次抗体 加入酵素受质使酵素呈色 以肉眼或仪器读取呈色结果三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认 因此专一性相当高 但此待测抗原必须是多价抗原 如此才可获得两种以上的专一性抗体 以分别进行夹心 而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心 所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的 间接法间接法常用于检测抗体 一般之操作步骤为 将已知之抗原固著于塑胶孔盘上 完成后洗去多余之抗原加入待测检体 检体中若含有待测之一次抗体 则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结洗去多余待测检体 加入带有酵素之二次抗体 与待测之一次抗体键结洗去多余未键结二次抗体 加入酵素受质使酵素呈色 藉仪器 ELISAreader 测定塑胶盘中的吸光值 OD值 以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原的含量 竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制 一般用于检测小分子抗原 将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上 完成后洗去多余抗体 加入待测检体 使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 加入带有酵素之抗原 此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结 由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限 因此当检体中抗原的量越多 则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少 亦即 两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结 即所谓竞争法之由来 洗去检体与带有酵素之抗原 加入酵素受质使酵素呈色 当检体中抗原量越多 代表塑胶孔盘内留下之带有酵素的抗原越少 显色也就越浅 当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原 或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时 一般会考虑使用竞争法ELISA 免疫胶体金技术 免疫胶体金技术 Immunecolloidalgoldtechnique 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术 胶体金是由氯金酸 HAuCl4 在还原剂如白磷 抗坏血酸 枸橼酸钠 鞣酸等作用下 聚合成为特定大小的金颗粒 并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态 称为胶体金 胶体金在弱碱环境下带负电荷 可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合 由于这种结合是静电结合 所以不影响蛋白质的生物特性 胶体金除了与蛋白质结合以外 还可以与许多其它生物大分子结合 如SPA PHA ConA等 根据胶体金的一些物理性状 如高电子密度 颗粒大小 形状及颜色反应 加上结合物的免疫和生物学特性 因而使胶体金广泛地应用于免疫学 组织学 病理学和细胞生物学等领域 胶体金标记抗体 游离 重组抗体 固定 硝化纤维薄膜 吸水垫 指示垫 储存垫 滤纸 抗原 固定 斑点金免疫渗滤测定法 dotimmuno goldfiltrationassay DIGFA 此法原理完全同斑点免疫金染色法 只是在硝酸纤维膜下垫有吸水性强的垫料 即为渗滤装置 在加抗原 抗体 后 迅速加抗体 抗原 再加金标记第二抗体 由于有渗滤装置 反应很快 在数分钟内即可显出颜色反应 此方法已成功地应用于人的免疫缺陷病病毒 HIV 的检查和人血清中甲胎蛋白的检测 胶乳颗粒增强比浊法 particle enhancedturbidimetricimmunoassay PETIA 是近年来出现的一种较为稳定 准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法 PETIA法大体分为两种 一种是散射比浊检测法 另一种是透射比浊检测法 这两种方法的基本原理非常相似 都是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆抗体 当交联有抗体的微球与抗原结合后 在短时间内会迅速聚集在一起 改变了反应液的散光性能或透光性能 而且 反应液散光性能或透光性能 即吸光度 的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性 在一定范围内可以反映被测抗原的浓度 PETIA检测方法是在均相反应体系中进行抗原 抗体反应及结果的测定 抗原 抗体反应后 直接测定反应液的吸光度值 省却了ELISA法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤 几分钟就能获得结果 省时省力 此外 纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂 环境等外界因素的干扰 稳定性和重复性都较好 能较真实地反映被测物质的含量 免疫比浊法的灵敏度虽然比ELISA法差一些 但足于检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值 可完全满足临床检测要求 405nm显色法 575nm免疫比浊分析 带通滤波器 卤素灯光源 检测单位的光敏二极管 凝集颗粒 未凝集颗粒 检测光 免疫层析法 immunochromatography 是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术 其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带 当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品 尿液或血清 后 由于毛细管作用 样品将沿着该膜向前移动 当移动至固定有抗体的区域时 样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合 若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色 从而实现特异性的免疫诊断 单向免疫扩散法含有特异抗体的琼脂板中打孔 并在孔中加定量的抗原 当抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合 即形成白色沉淀环 其直径或面积能够与抗原浓度呈正相关 同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线 即可用以定量检测未知标本的抗原浓度 mg ml或IU ml 应用这一实验方法可检测正常人群或患者血清IgG IgA及IgM的含量及正常值 双向免疫扩散法一种分析鉴定抗原 抗体纯度和抗原特异性的试验 即抗原和抗体分子在凝胶板上扩散 二者相遇并达到最适比例时形成沉淀线琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动 沉淀带形成一种特异性的半渗透性屏障 阻滞相同抗原抗体复合物 而允许不同的分子通过沉淀线的特征与位置 1抗原 抗体的特异性和浓度 2抗原 抗体分子的大小3扩散率当抗原体存在多种成分时 将呈现多条沉淀线以至交叉反应线 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性 纯度或浓度比较抗原之间的异同点 因而应用范围较广 免疫荧光染色法此法基本原理是将已知抗体或抗原标记荧光素 用此特异性试剂 浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本 借助抗原抗体的特异性结合 于抗原或抗体的存在部位呈现荧光 从而可以定位标本内的抗原或抗体 对流免疫电泳在电场作用下进行的双向凝胶扩散 其原理是 在通电的琼脂中 抗原和抗体向相反的电极移动 当它们在最适宜的比例处相遇时 可形成白色的沉淀线 实际上 这是一种加速的双向琼脂扩散试验 试验所需时间短 敏感性高 但特异性比较差 一般用于各类蛋白的定性分析和半定量测定 电泳免疫扩散法 火箭电泳 在电场下进行的单向琼脂扩散 用于检查标本中某一Ig或抗原的含量 方法是 将含有已知抗体的琼脂制成琼脂板 待冷凝后 在琼脂板的阴极端打一排小孔 向各孔中加入定量的待检样品和不同稀释度的标准抗原 经电泳后 抗原在扩散过程中与抗体结合 在适宜比例处形成锥形的沉淀峰 其形状如火箭 沉淀峰的高低与抗原浓度成正比 利用这一方法 能较快地测出标本中的抗原含量 免疫粘附血凝试验根据抗原 抗体复合物在C3存在时能粘附到灵长类红细胞或非灵长类血小板上的现象检查抗原或抗体的方法 这一方法是20世纪60年代发展起来的 具有高度敏感性 其原理是 抗原 抗体 补体 C142 的复合物可以吸附数百个C3分子 而活化后的每个C3分子又可与有C3受体的指示细胞 如人的O型红细胞 发生粘附作用 所以只要试验系统中存在极少量的抗原 抗体复合物 就可通过与补体系统作用使红细胞凝集 此方法操作简便 不用溶血素 不需滴定补体 可用于检测病人血清中有无乙型肝炎表面抗原 抗人