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烟叶中游离氨基酸总量的测定烟叶中游离氨基酸总量的测定 一、原理 游氨基酸可与水合茚三酮反应，产生蓝紫色化合物。在一定范围内，颜色的深浅游离氨基酸含量成正比，可用分光光度计，在570nm下测得蓝紫色溶液的消光值，根据标准曲线计算未知样品中游离氨基酸的含量。 二、实验材料、仪器和试剂 1. 材料 新鲜烟叶 2. 仪器 (1)研钵、漏斗、三角瓶、滤纸 (2)具塞刻度试管20ml (3)刻度吸管(5ml、1ml、移液枪0.1ml) (4)沸水浴电炉 (5)分光光度计 3. 试剂 (1)10,乙酸 (2)水合茚三酮试剂:称取0.6g茚三酮加入15ml正丙醇溶解，再加入30ml正丁醇及60ml乙二醇，最后加入9mlpH4.5乙酸乙酸钠缓冲液，混匀，贮于棕色瓶于冰箱内保存，10日内有效。 (3)乙酸乙酸钠缓冲液(PH4.5):称取54g乙酸钠(NaAc?3HO)，加入蒸馏水加热至沸，冷却2后加30ml冰乙酸，用蒸馏水定容至100ml。 (4)氨基酸标准液:称取80?烘干的亮氨酸46.8mg，以10,异丙醇溶解，并定容至100ml，取此液5ml用蒸馏水稀释至50ml，即为每毫升含氮5ug的标准液。 (5)0.1,的抗坏血酸:50mg溶于50ml水中，现用现配 (6)60,乙醇 三、操作步骤 1. 样品提取 取新鲜待测烟叶，剪碎，于研钵中加5ml10,乙酸，研磨，转移至100ml容量瓶中，用蒸馏水定容后，用干滤纸过滤至三角瓶中。 2. 标准曲线制作 取6支20ml刻度试管，按表加入试剂后，盖上玻塞，混匀，置沸水浴中15分钟，然后取出在冷水浴中迅速冷却，使加热时形成的红色逐渐被空气氧化而褪色，直到溶液呈蓝蓝紫色时，用60,乙醇定容至20ml，摇匀，在570nm下测消光值。以每管含氮量为横坐标，消光值为纵坐标作标准曲线。 管号 试剂 1 2 3 4 5 6 标准亮氨酸 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 无氨蒸馏水 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1 水合茚三酮试剂 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0.1,抗坏血酸 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 每管含氮量(ug) 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 3. 样品测定 取样品滤液1ml，放入20ml具塞刻度试管中，加蒸馏水1ml，水合茚三酮3ml，0.1,抗坏血酸0.1ml，同标准曲线方法显色、比色。根据消光值在标准曲线上查的样品的含氮量X(ug) 四、结果计算 按下式计算出100g鲜样中氨基酸的含量: 样品提取液总体积 X(ug)? 测定所取滤液体积 氨基酸含量(mg/100g鲜样), ?100 样品重(g)?100 五、注意事项 比色应在显色后1小时内进行;实验用水为无氨水;严格掌握抗坏血酸用量 注:缓冲液配制时可适当加热，以防结晶(乙酸-乙酸钠)(最好用无离子水); 配制水和茚三酮时，将所有醇加入后再溶解(盖盖子);
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