基于碳纳米管修饰电极检测有机磷农药的生物传感器.docx

基于碳纳米管修饰电极检测有机磷农药的生物传感器润 , 郝玉翠 , 康天放 刘(北京工业大学环境与能源工程学院 , 北京 100022)摘 要 :报道了一种用于检测有机磷农药的安培型生物传感器 , 利用戊二醛交联法将乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白固定在羧基化多壁碳纳米管修饰玻碳电极 表面 , 制备了可应用于检测有机磷农药的新型生物传感器 , 并确定了最佳工作 条件 。该方法具有良好的重现性和回收率 , 当辛硫磷及氧化乐果的浓度分别在5 . 0 10 - 4 5 . 0 10 - 1 gl 和 1 . 0 10 - 3 5 . 0 10 - 1 gl 范围内时 , 抑制率与其浓度的对数呈线性关系 , 检出限按抑制率为 10 %时的农药浓度计算 , 可分别达 到 3 . 6 10 - 4 gl 和 5 . 9 10 - 4 gl 。关键词 :生物传感器 ; 碳纳米管 ; 乙酰胆碱酯酶 ; 有机磷农药中图分类号 :o657. 1文献标识码 :a文章编号 :100020720 (2007) 092009204气相色谱法和高效液相色谱法等广泛用于有机磷农药的测定 , 但都需要比较长的分析时间和 样品前处理等1 , 所以 , 建立快速 、灵敏 、可靠的 有机磷农药的检测方法对环境保护和食品安全都 具有重要的意义 。乙酰胆碱酯酶 (ache) 能够选择 性地催化底物水解 , 且其催化活性能被有机磷农 药或氨基甲酸酯类农药所抑制 , 利用这一特性可 制成用于测定有机磷农药的生物传感器2 。碳纳 米管是一类新型的纳米材料 , 它具有很高的比表 面积和优良的电催化性能 , 利用碳纳米管制备各 类电化学生物传感器的研究已经有文献报道3 , 4 。 但将碳纳米管用于制备有机磷农药生物传感器的 文献报道很少5 。本文采用戊二醛作为交联剂 , 牛血清白蛋白 作惰 性 蛋 白 质 , 将 ache 固 定 在 多 壁 碳 纳 米 管 (mwnt) 修饰玻碳电极表面 , 制成生物传感器 , 用 电化学分析方法检测了有机磷农药 , 对生物传感 器的制备条件及应用进行了研究 。1实验部分1 . 1仪器和试剂chi660a 电化学工作站 (上海辰华仪器有限公司) , phs - 3c 精密型酸度计 ( 上海雷磁仪器厂) 。电化学实验均采用三电极系统 : 玻碳电极 ( gce) 或生物传感器作为工作电极 , 饱和甘汞电极 ( sce) 为参比电极 , 铂电极为对电极 。乙酰 胆 碱 酯 酶 ( ec3 . 1 . 1 . 7 ; type , sigma 公 司) , 氯化乙酰硫代胆碱 (asch) 和氯化212甲基吡啶222甲醛肟 (22pam) 购自 sigma 公司 , 多壁碳纳米管 由清华大学化工系反应工程实验室提供 , 农药为40 %氧化 乐 果 乳 油 ( 河 北 新 兴 化 工 有 限 公 司 ) 和40 %辛硫磷乳油 ( 山东和乐集团乐陵农药厂) , 农 药浓度根据所标示的有效成分计算 。其它试剂均 为分析纯 。1 . 2 生物传感器的制备采用 浓 hno3 回 流 的 方 法 将 mwnt 羧 基 化 :mwnt 于 120 烘干研磨 , 浓 hcl 中超声 7 h 纯 化 , 二次水洗至中性 , 抽滤 , 120 烘干研磨 。浓 hno3 中 140 回流 5 h , 二次水洗至中性 , 抽滤 ,120 烘干研至粉末 , 备用 。称取 5 mg 上述 mwnt 粉末超声分散于 10 ml n ,n2二甲基甲酰胺 (dmf) 溶剂中 , 形成黑色液 , 备用 。在抛光机上用粒径为 收稿日期 : 2006207227 ;修订日期 : 2006210221基金项目 : 国家自 然 科 学 基 金 ( 20247002) 、北 京 市 自 然 科 学 基 金 ( 8062010) 和 北 京 市 教 育 委 员 会 科 技 发 展 基 金( km200310005008) 项目资助作者简介 : 刘 润 (1980 - ) , 女 , 硕士研究生 9第 26 卷第 9 期2007 年 9 月分析试验室chinese journal of analysis laboratoryvol . 26. no . 92007 - 90 . 5 m 的 al2 o3 粉悬浊液将玻碳电极抛光成镜面后 , 再用蒸馏水清洗干净 , 分别在乙醇和二次水 中超声清洗 5 min , 取上述分散液 4l 滴于电极表 面 , 室温下自然干燥 。将 50l 0 . 1 ul 的乙酰胆碱酯酶溶液 , 5l5 %的戊二醛溶液和 5l 体积分数 4 %的牛血清白 蛋白 (bsa) 溶液充分混合 。取 6 l 混合溶液滴于mwnt 修饰电极表面 , 室温下自然干燥 , 备用 。1 . 3 实验方法以生物传感器作为工作电极 , 饱和甘汞电极 为参比电极 , 铂电极为对电极 , 取 10 ml 0 . 1 moll p h 7 . 5 的磷酸盐缓冲溶液 ( pbs) 于电解池中 , 将三电极浸入其中 , 待背景电流衰减到稳态值后 , 加入 100 l 0 . 05 moll 乙酰硫代胆碱溶液 , 使其浓 度达到 5 10 - 4 moll , 搅拌 2 min , 在静止的溶液中记录所产生的稳态电流 i1 。在另一份磷酸盐缓冲溶液中加入一定浓度的农药 , 温育 15 min 后 , 加入同样浓度的乙酰硫代胆碱溶液 , 测得稳态电 流 i2 。计算出各种浓度的农药相对应的稳态电流液中农药浓度的增加 , ache 受到抑制的程度也相应增大 , 生成的硫代胆碱的量随之减少 , 电解电 流也相应减小 。因此 , 可通过测量电流信号大小 来测定有机磷农药的浓度 。碳纳米管在浓 hno3 中的氧化处理 , 被截成短管 , 并且产生许多羧基功 能基团7 , 这些基团为硫代胆碱的电化学氧化提 供了较多的活性位点 。由此可以认为 , 图 1 中曲线 b 位于 + 0 . 18 v 的氧化峰是酶促反应产物硫代胆 碱在电极表面的电催化氧化峰 , 因此 , 本文选用 安培法实验的工作电位为 : + 0 . 2 v 。衰减值 , 并根据下式计算抑制率 ( i%) 6:图 1 以 achemwntgce 为工作电极的循环伏安图fig. 1 cyclic volta mmogra ms at the achemwntgcea - pbs 底液 ; b - 含 5 10 - 4 moll asch 的 pbs 底液 ; 扫描 速率 : 100 mvsi1 - i2i% =(1)100i12 结果与讨论2. 1 生物传感器对农药的响应分别 在 空 白 pbs 中 和 在 含 5 . 0 10 - 4 moll asch 的 pbs 中用生物传感器 achemwntgce 作为工作电极进行循环伏安实验 (图 1) , 实验结果表明 , asch 溶液在 + 0 . 18 v 电位处出现了一个氧化 峰 (曲线 b) 。当用不含 mwnt 的生物传感器 achegce 在上述溶液中进行循环伏安扫描时 , 未出现阳极峰 , 由此可见 , 基于 mwnt 修饰电极的生物 传感器 achemwntgce 对乙酰硫代胆碱的响应 灵敏度明显高于没有 mwnt 的生物传感器 ache gce , 说明 mwnt 能有效地催化硫代胆碱的电化学氧化 。以 asch 作为底物 , 在 ache 的催化作用 下 , 发生以下反应 :2 . 2 碳纳米管用量的选择用安培法考察了 mwnt 用量对硫代胆碱在生 物传感器上的氧化电流的影响 (图 2) 。实验结果表 明 : 当 固 定 ache 和 bsa 的 用 量 分 别 为 0 . 5u 和20g 时 , 氧化电流最初随 mwnt 用量的增加而显 著增加 , 这是因为随 mwnt 用量的逐渐增加 , 电 极表面催化活性位点增多 , 导致氧化电流增加 , 但是 当 mwnt 用 量 超 过 2 g 时 , 氧 化 峰 电 流 随 mwnt 用量的逐渐增加而降低 , 这是由于电极表 面碳纳米管修饰层厚度过大 , 阻碍了硫代胆碱的传质以及与电极的电子交换 。本文以 mwnt 用量 为 2g 来制备生物传感器 。2 . 3 固定酶条件的优化酶层的厚度对底物在电极上的响应有较大影 响 , 因此对在 mwnt 修饰电极表面 ache 的用量及 bsa 的用量进行了选择 , 首先固定 bsa 的用量 为 20 g , 考察了在修饰电极表面固 定 不 同 量 的 ache 对乙酰硫代胆碱在生物传感器上响应电流的 ache+ch3 cosch2 ch2 n( ch3 ) 3 + h2 o+( ch3 ) 3 n(2)ch2 ch2 sh + ch3 cooh+所生成 的 硫 代 胆 碱 分 子 ( ch3 ) 3 n ch2 ch2 sh中的巯基容易被电化学氧化成二硫基 , 当农药存 在时 , 酶的活性受到抑制 , 因此电流减小 。随着溶 10第 26 卷第 9 期2007 年 9 月分析试验室chinese journal of analysis laboratoryvol . 26. no . 92007 - 9影响 。如图 3 所示 , 当在电极上固定 0 . 5u 酶时 ,响应电流最大 。当酶量再增加时 , 酶层变厚 , 阻碍 了酶促反应产物硫代胆碱向玻碳电极表面的扩散 , 降低了灵敏度 。但是如果用量太少 , 酶促反应不 完全 , 也会降低灵敏度 。故选用 ache 的最佳用量为 0 . 5u 。作用随温育时间的变化情况 ( 图 4) 。实验结果表明 : 酶的残留活性在抑制作用开始的 15 min 内迅 速减小 , 抑制作用大约可完成 95 % , 在这之后变 化不大 , 所以在农药的测定过程中 , 将温育时间 选定为 15 min 。图 4 ache 残留活性随温育时间的变化趋势the variational trends of the residual activity of achewith the incubation timeasch 浓度 : 5 10 - 4 moll , 其它条件同图 2fig. 4图 2 mwnt 的用量对 asch 安培响应的影响fig. 2 effect of the a mount of mwnt on the a mperometric response of aschasch 浓度 : 8 10 - 4 moll ;底液 : pbs ;工作电位 : + 0. 2 v由于有机磷农药对 ache 有抑制作用 , 这将会导致在含农药的底液中所产生的氧化电流小于空 白底液中产生的氧化电流 , 电流衰减与农药的浓 度有一定的定量关系 。以抑制率对农药浓度的对 数作图 , 结果表明 , 农药对 ache 的抑制率与农药 浓度的对数在一定范围成线性关系 。检出限按抑制率为 10 %时的农药浓度计算8 , 检测的各种结 果如表 1 所示 。测定完毕的酶电极冲洗干净后 , 将 其置于 0 . 1 moll 的 22pam 溶液中 , 在室温下浸泡30 min , 可以将受到抑制的 ache 活化 , 用于下一图 3 ache 负载量对 asch 的安培响应的影响fig. 3 effect of ache loa ding on the a mperometric response of asch实验条件同图 2- 2次测定 。若电极每次都测定 1 10 gl 的农药 ,采用此法活化 , 经过约 6 次测定之后 , 酶的活性将 降低到初始值的 85 % 。称取一定量新鲜小白菜菜叶 , 破碎后 , 置于 小烧杯中 , 取一定量的有机磷农药溶液 , 将其喷撒于菜叶样品上 , 加盖 , 放置过 夜 。先 将 样 品 水 洗 , 再用丙酮提取该样品中的农药 , 提取液转移 至 10 ml 容量瓶中 , 定容 , 用本文提出的生物传感器安培法对其进行测定 , 根据响应电流值计算抑制率 , 并在标准曲线上查得相应的农药浓度 , 同 样条件 , 平行测定 5 份 , 作回收率实验 , 测定结果 如表 2 所示 。辛硫磷和氧化乐果的加标回收率分别为 104 . 5 %和 97 . 5 % , 说明该生物传感器在有机磷农药残留的检测中有着良好应用前景 。 112 . 4 乙酰硫代胆碱的测定实验结果表明 , 响应电流与乙酰硫代胆碱浓度 之间在 110 10 - 6 715 10 - 4 moll 范围内呈线性 关系 , 线性回归方程为 : i (a) = 51147 c (mmoll) +012671 , 相关系数为 019953 。用基于多壁碳纳米管修 饰电极的生物传感器安培法对 5 10 - 4 moll 乙酰 硫代胆碱进行 10 次平行测定 , 得到的相对标准偏差为 313 % , 说明该传感器具有良好的重现性 。2 . 5 农药的测定用安培法研究了有机磷农药对 ache 的抑制第 26 卷第 9 期2007 年 9 月分析试验室chinese journal of analysis laboratoryvol . 26. no . 92007 - 9表 1 线性范围及检出限linear range and detection limitta b. 1线性范围 (gl)检出限 (gl)农药名称线性回归方程相关系数5. 0 10 - 4 5. 0 10 - 11. 0 10 - 3 5. 0 10 - 13. 6 10 - 45. 9 10 - 4辛硫磷氧化乐果i% = 18. 17lg c + 72. 57i% = 21. 60lg c + 79. 760. 99770. 9987表 2实际样品的加标回收率ta b. 2 the recoveries of the real sa mples样品初始浓度 (gl)标准加入浓度 (gl)检测浓度 (gl)rsd% ( n = 5)回收率%4. 86 10 - 35. 10 10 - 35. 00 10 - 35. 00 10 - 39. 98 10 - 29. 92 10 - 3辛硫磷氧化乐果3. 84. 2102. 496. 4参考文献mulchandani a , chen w , mulchandani p et al . biosensors and bioele2ctronics , 2001 , 16 (4 - 5) : 225高慧丽 , 康天放 , 王小庆等 . 环境化学 , 2005 , 24 (6) :707zhao y d , zhang w d , chen h et al . sensors and actua2tors b , 2002 , 87 : 168davis j j , green m l h , hill h a o et al . inorg chimacta , 1998 , 272 : 261deo r p , wang j , block i et al . anal chim acta , 2005 ,530 : 185zhang s , zhao h , john r. biosensors and bioelectronics ,2001 , 16 (9 - 12) : 1119王宗花 , 罗国安 . 分析化学 , 2003 , 31 (8) : 1004lee h s , kim y a , cho y a et al . chemosphere , 2002 ,46 (4) : 57151627834determination of organophosphorus pesticides using biosensors ba sed on carbon nanotubes modif ied electrodesl iu run , hao yu2cui and kang tian2f ang 3 ( college of environmental and energy engineering , beijing university of technology , beijing 100022) , fenxi shiyanshi , 2007 , 26 (9) : 912abstract : an amperometric biosensor for the detection of organophosphorus pesticides was described. acetylcholines2 terase and bov