明目地黄丸中山茱萸的含量测定.docx

实训二十四 明目地黄丸中山茱萸的含量测定一、实训目的1.掌握薄层扫描法的一般操作步骤和技能2.理解外标二点法测定熊果酸含量的原理3.了解双波长薄层扫描法含量测定的设计思路。二、测定依据1. 明目地黄丸药品标准中国药典2005年版（一部）正文部分492页 【处方】 熟地黄160g、山茱萸（制）80g、牡丹皮60g、山药80g、茯苓60g、泽泻60g、枸杞子60g、菊花60g、当归60g、白芍60g、蒺藜60g、石决明（煅）80g。 【含量测定】 取本品水蜜丸或小蜜丸，切碎，取水蜜丸10g或小蜜丸18g，精密称定；或取重量差异项下的大蜜丸，剪碎，混匀，取18g，精密称定。加水50ml，放置使溶散，滤过，药渣用水80ml洗涤，在室温干燥至呈松软的粉末状，在100烘干，连同滤纸一并置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流提取4小时，提取液回收乙醚至干，残渣用石油醚（3060）浸泡2次，每次20ml（浸泡约2分钟），倾去石油醚，残渣加三氯甲烷-无水乙醇（2: 3）的混合液适量，微热使溶解，转移至5ml量瓶中，加上述混合液至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另精密称取熊果酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录 B）试验，精密吸取供试品溶液5l、对照品溶液2l与5l，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-氯仿-乙酸乙酯-冰醋（20:5:8:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在110加热45分钟，至斑点显色清晰，取出，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定，照薄层色谱法（附录 B薄层扫描法）进行扫描，波长：=540nm，=700nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度积分值，计算，即得。 本品含山茱萸以熊果酸（C30H48O3）计，水蜜丸每1g不得少于0.090mg，小蜜丸每1g不得少于0.070mg，大蜜丸每丸不得少于0.63mg。 2. 薄层色谱法中国药典2005年版（一部）附录 B 三、测定原理1.本品系由熟地黄、山茱萸（制）、牡丹皮、山药、白芍等12味药材制备而成，剂型有水蜜丸、小蜜丸和大蜜丸。该药品质量标准收载了山茱萸、牡丹皮和白芍的含量测定方法。前者采用薄层扫描法，后二者采用高效液相色谱法。2.山茱萸为本品君药，熊果酸为其代表性成分，故药品标准以熊果酸为指标采用薄层扫描外标两点法对山茱萸进行含量测定。3.熊果酸为游离三萜类化合物（图5-38），结构中含有羟基和羧基，具有一定极性，难溶于石油醚和水，溶于乙醚、三氯甲烷、甲醇和乙醇等。因此样品前处理时，加水溶散样品，滤渣用水洗涤除去水溶性杂质。干燥滤渣加乙醚回流提取，将熊果酸定量提取出来。乙醚提取物先用石油醚浸泡，溶去脂溶性杂质，然后加三氯甲烷-无水乙醇混合液微热溶解、定容，制成供试品溶液。图5-38熊果酸结构式4.熊果酸具有酸性，为了防止其色谱斑点产生拖尾现象，在展开剂中加入少量冰醋酸。5.熊果酸结构中无较长的共轭体系，故本身既无荧光性质也无紫外-可见吸收，其斑点需喷洒硫酸溶液显色后才能用可见光扫描测定。显色机理可能是：在硫酸的作用下，熊果酸发生氧化、脱水、双键位移等反应，生成具较长共轭体系的红紫色物质且在540nm波长处呈最大吸收。显色后的斑点不稳定，需覆盖玻璃板再行扫描。6.含量测定原理：以熊果酸为指标，首先利用溶剂法将熊果酸从样品中提取出来，经薄层色谱分离得到其斑点，通过随行分析的对照品定位。然后分别对供试品中熊果酸斑点和对照品斑点进行扫描，根据对照品斑点质量和吸光度积分值建立直线方程，将供试品熊果酸斑点吸光度积分值代入直线方程计算，即可得到熊果酸含量。四、仪器与试剂薄层扫描仪、恒温干燥箱、托盘天平（感量0.1g）、分析天平（感量0.0001g）锥形瓶、量筒、索氏提取器、水浴锅、蒸发皿、硅胶G薄层板、展开缸、点样器（微升毛细管或微量注射器）、胶布、玻璃板等三氯甲烷、无水乙醇、环己烷、甲酸、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、10%硫酸等。五、实验步骤与内容1.供试品溶液的制备 用托盘天平（感量0.1g）称取本品水蜜丸40g，称量范围39.5 40.5g；研钵研碎，再用分析天平（感量0.0001g）从中精密称取10g，称量范围9.5000 10.5000g（保留四位有效数字）。或用托盘天平（感量0.1g）称取小蜜丸或重量差异下的大蜜丸60g，称量范围59.5 60.5g；剪刀剪碎，混匀，再用分析天平（感量0.0001g）从中精密称取18g，称量范围17.5000 18.5000g（保留四位有效数字）。将样品置100ml锥形瓶中，用量筒量取蒸馏水50ml置锥形瓶中，摇匀，放置使药粉溶散。常压过滤，弃去滤液，用量筒量取蒸馏水80ml，分次洗涤药渣，弃去洗液，药渣连同滤纸置室温下干燥至呈松软的粉末状，置恒温干燥箱中于100烘干。药渣连同滤纸一并置250ml索氏提取器内，加乙醚150ml200ml，水浴锅加热回流提取4小时，用同一索氏提取器内浓缩提取液，回收乙醚至小体积并移至蒸发皿中，少量多次地往索氏提取器平底烧瓶中加入乙醚，洗涤烧瓶内壁，洗液并入蒸发皿中，在通风橱中水浴加热挥干乙醚得残渣。用量筒量取20ml石油醚（3060）加至蒸发皿中，浸泡残渣约2分钟，小心倾去石油醚，如此再浸泡一次。用量筒量取三氯甲烷-无水乙醇（3:2）混合液3ml，加至蒸发皿中，水浴微热使残渣溶解，小心转移至5ml量瓶内，再用上述混合溶液洗涤蒸发皿内壁2次，每次1ml，洗液并入量瓶中，最后往量瓶中小心滴加上述混合溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液。2.对照品溶液的制备 在10ml量瓶中，用分析天平（感量0.0001g）精密称取熊果酸对照品50mg，称量范围0.04950.05050g，加无水乙醇溶解并定溶至刻度，摇匀，制成每1ml含4.955.05mg熊果酸的溶液，作为对照品溶液3.测定方法 用微升毛细管或微量注射器精密吸取供试品溶液5l或10l、对照品溶液4l与8l，按外标两点法点样要求，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，形成至少8个原点，原点间距不得小于8mm，故应选用15cm20cm规格的薄层板。以环己烷-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（20:5:8:0.5）为展开剂，展开10cm左右，展开前要充分“饱和”30分钟。展开完毕，取出薄层板，晾干至无展开剂气味，在薄层板上均匀喷以显色剂10%硫酸乙醇溶液，置恒温干燥箱中110加热45分钟，至呈现一系列颜色清晰的斑点，放冷，在薄层板上覆盖同样大小的玻璃板，周围用胶布固定。根据对照品斑点位置和颜色，确定供试品色谱中熊果酸斑点位置。按照中国药典附录 B中关于薄层色谱扫描法规定，分别对上述两种斑点进行扫描，波长：=540nm、=700nm，测定供试品中熊果酸吸光度积分值与对照品吸光度积分值，供含量计算用。4.含量计算（1） 根据对照品数据求出斜率（F1）和截距(F2)，建立直线方程。 M大M小 M F1 A + F2 A大A小 F1 A大M小A小M大 A大A小 F2 M大为大点样量（8l）对照品斑点的质量；M小为小点样量（4l）对照品斑点的质量；A大为大点样量（8l）对照品斑点吸光度的积分值；A小为小点样量（4l）对照品斑点吸光度的积分值。（2） 将供试品被测斑点荧光强度积分值A供代入直线方程，求供试品被测斑点中熊果酸的质量M供。（3）求供试品中熊果酸的含量(根据药品标准规定，确定含量单位和有效数位)。 M供稀释倍数取样量水蜜丸和小蜜丸中的含量（mg/g） M供稀释倍数平均丸重取样量大蜜丸的含量（mg/丸）=【操作要点】本实验为定量分析，各种操作应正确规范，尤其是样品前处理要防止“跑、冒、滴、漏”。薄层板应使用市售薄层板。配制展开剂时，不能在一个量筒中“累加”，应按规定比例分别量取各种溶剂，加入一锥形瓶，摇匀，放置，使成澄清一相溶液备用，实验中使用的薄层板较宽，易产生“边缘效应”，影响测量工作。故展开前应充分“饱和”，在展开缸内壁贴附滤纸条吸着展开剂，可提高“饱和”速率，克服“边缘效应”。加热薄层板显色时，应在恒温干燥箱中110加热45分钟，至斑点显色清晰即可，不得超温超时，更不能使用电炉加热，否则薄层板易碳化变黑。扫描时应沿展开方向自下而上进行扫描，不能横向扫描。测定记录中应包含薄层色谱扫描图、峰面积积分值、工作曲线、回归方程和相关系数及测定结果计算等。根据实际情况，可调整供试品溶液及对照品溶液的点样量，便于测定。为保证测定结果的准确性，采用外标二点法测定时，供试品斑点的峰面积应在两个对照品斑点的峰面积值之间。（五）结果判断将测试结果与药品标准规定比较，不低于含量限度者判定为符合规定。（六）实训思考1. 制备供试品溶液时，除去水溶性杂质和脂溶性杂质的方法是什么？ 2.薄层色谱展开剂中为什么要加入少量甲酸？3.采用外标二点法测定时，为什么要求供试品斑点的峰面积应在两个对照品斑点的峰面积值之间？4.对本品进行含量测定时，为什么牡丹皮和白芍采用高效液相色谱法，而山茱萸却采用薄层色谱扫描法？（七）实训测试明目地黄丸中熊果酸含量测定实训测试表（百分制）测试指标测试内容及观测点分值评价等级ABCDE1.00.70.50.30着装2测量依据写出测定依据的来源3相关知识1.为什么选择熊果酸作为山茱萸含量测定的指标？2.本法属于何种测定方法？3.写出本法的测定原理。9操作步骤