N-羧甲基壳聚糖对皮肤创伤修复功能的研究.doc

N-CMC对皮肤创伤修复功能的研究N-羧甲基壳聚糖对皮肤创伤修复功能的研究摘要甲壳素(Chitin)是自然界可再生的一种聚乙酰氨基葡萄糖高分子多糖。壳聚糖(Chitosan)是甲壳素脱乙酰基的产物，由于其资源丰富、天然无毒、无抗原性、生物相容性好、可生物降解且具有特殊的生物活性，近10多年来，对壳聚糖及其衍生物的性质、功能的研究和应用开发已得到广泛的重视。其研究应用范围已涉及到工业、农业、生物工程、医药卫生、食品工业、生物医用材料、畜牧水产、化学化工等众多领域。在医学领域更是取得了长足的进展，已有较多报道。甲壳素和壳聚糖均不能直接溶于水，极大的限制了应用。而壳聚糖C6位羟基最活泼易于进行羧化反应，通过改性后的羧甲基壳聚糖(CM-Chitosan)具有良好的水溶性，因此在医药、化妆品等领域有着广泛的应用前景。皮肤创面组织正常而又快速的修复一直是基础医学的研究热点之一，壳聚糖及其衍生物具备的诸多优良性质使其成为该领域颇受关注的天然高分子材料本研究拟在多年壳聚糖相关研究基础上，对目前尚未报道的N-羧甲基壳聚糖（N-CMC）对创伤修复的作用和机理进行研究。首先以壳聚糖、乙醛酸为原料，制备N-CMC敷料，对其羧化度、脱乙酰度、分子结构、生物相容性等性质进行评价；继而制备度烫伤动物模型，根据创面出血量、愈合创面局部特征、创面愈合率、创面愈合时间、组织学特征等指标评价创面修复效果关键词N-CMC、羧化度、水溶性、创伤修复Thesis TitleChitin (Chitin) is a natural renewable polymer poly acetylglucosamine polysaccharide. Chitosan (Chitosan) is the product of chitin deacetylation, because of its abundant resources, natural non-toxic, non-antigenic, biocompatible, and can be biodegradable and has a specific biological activity of the past 10 years, on the nature of chitosan and its derivatives, function and application development has been widely appreciated. Application of their research has been involved in industry, agriculture, biological engineering, medicine and health, food industry, biomedical materials, animal aquaculture, chemical industry and other fields. In medicine is made remarkable progress, there are more reports. Chitin and chitosan are not directly soluble in water, which greatly limits the application. The C6 hydroxyl groups of chitosan were the most lively and easy-to-carboxylation reaction, through the modified carboxymethyl chitosan (CM-Chitosan) with good water-soluble, so in medicine, cosmetics and other fields have broad application prospects. Wound repair of normal tissue without rapid medical research has been the basis for one of the hot, chitosan and its derivatives have many excellent properties make it a popular concern in the field of natural polymer materials In this study, chitosan in the many years of research basis, has not yet reported N-carboxymethyl chitosan (N-CMC) on the role and mechanism of wound healing research. First, chitosan, glyoxylic acid was used to prepare N-CMC dressing, their carboxylation degree of deacetylation degree, molecular structure, to evaluate the biocompatibility and other properties; then prepared with a burn animal model of grade , The wounds bleeding, healing wounds as well as characteristics of wound healing rate, wound healing time, histologic characteristics of the wound healing effect evaluation indexAbstractN一carboxymethylchitosan；degree of substitution；目录第一章 文献综述51 甲壳素及其性质52 壳聚糖及其性质63 壳聚糖的衍生物及主要衍生物的性质74羧甲基化壳聚糖84. 1N- CMC的制备84.2 N-CMC的应用价值9第二章 N-羧甲基壳聚糖的制备和理化性质研究111 材料及仪器111.1材料及试剂111.2主要仪器112 实验方法112.1 N-CMC的制备112.2 N-CMC的纯化122.3 N-CMC的羧化度测定122.4N-CMC的分子量大小测定132.5N-CMC的粘度测定132.6N-CMC的水分测定133 结果与讨论133.1 N-CMC的制备133.2 N-CMC的纯化133.4 N-CMC的羧化度测定143.4N-CMC的分子量大小测定143.5N-CMC的粘度测定143.6N-CMC的水分测定14第三章、羧甲基壳聚糖对创伤修复的促进作用151 材料及仪器151.1材料及试剂151.2主要仪器152 实验部分152.1 动物的N-CMC皮刺152.2. N-CMC对皮肤创伤修复功能的研究153 结果与讨论163.1动物的N-CMC皮刺163.2 N-CMC对皮肤创伤修复功能的研究16第四章结论171 主要结论172存在的不足与进一步研究计划17参考文献18第一章 文献综述1 甲壳素及其性质甲壳素又称几丁质，化学名为(1，4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，也称为聚(N-乙酰基-D-葡糖胺)，它的化学结构和植物纤维素非常相似。都是六碳糖的多聚体，分子量都在100万以上。纤维素的基本单位是葡萄糖，它是由3002500个葡萄糖残基通过al，4糖甙链连接而成的链状聚合物。甲壳素的基本单位是乙酰葡萄糖胺，它是由10003000个乙酰葡萄糖胺残基通过1，4糖甙链相互连接而成聚合物。结构式如图图1.1Fig. 1.1甲壳素广泛分布于自然界甲壳纲动物（虾、蟹、昆虫）的甲壳，真菌和某些植物的细胞壁中，是一种天然有机高分子多糖.其蕴藏量在地球的天然有机高分子物质中占第二位，仅次于纤维素。甲壳素在270 左右分解，几乎不溶于水、稀酸、稀碱和一般有机溶剂。凡是含有甲壳素的生物体都可以用作制备甲壳素的原料，但从生产成本考虑，则通常用蟹壳和虾壳。制备甲壳素的主要操作是脱钙和脱蛋白。甲壳素的一般制备方法有Hackman法、Whistler和Bemiller法、Horowitz, Roseman和Blumenthal法、Broussignac法1。甲壳素资源丰富，制法简单，价格低廉，具有良好的成胶成膜性等理化性质，无毒且有良好的生物相容性，通过化学接枝改性，能与多种物质结合，被广泛应用于许多领域。2 壳聚糖及其性质壳聚糖是甲壳素在碱性条件下水解，脱去部分乙酰基而得到的，其化学名为：聚(1 ,4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，脱乙酰基程度(D.D)决定了大分子链上胺基(NH2)含量的多少,而且脱乙酰基程度增加,由于胺基质子化而使壳聚糖在稀酸溶液中带电基团增多,聚电解质电荷密度增加,其结果必将导致其结构,性质和性能上的变化，结构式见图1.2：图1.2Fig. 1.2 一般来说，脱乙酰度达到55%以上的甲壳素可称之为壳聚糖，更广泛的定义是：凡是能溶于1%乙酸或1%盐酸的甲壳素都可称之为壳聚糖。壳聚糖的正电荷是其各种生物学效应的基础，在各方面具有广泛的作用。Hong Kyoon NO等2、Tokura S等3、郑连英等4 等对壳聚糖的抑菌性进行了研究。Helander等5通过改变pH和添加盐离子，研究不同带电性壳聚糖的抗菌性，结果表明带正电荷的壳聚糖具有明显的抑菌效果，而不带电荷的壳聚糖抑菌能力明显减弱，因此认为壳聚糖的正电荷与微生物细胞膜表面的负电荷之间相互作用，阻止了营养物质向细胞内运输；导致细菌死亡。滕丽菊等6的研究表明：分子量大的壳聚糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有较强的抑菌作用，但当壳聚糖的氨基被保护而形成壳聚糖纳米粒子时，丧失了抑菌活性，因此认为，壳聚糖的抑菌作用与壳聚糖上游氨基的质子有密切联系。杜予民7等通过过氧化氢/醋酸体系降解壳聚糖，得到分子内含有羧基的降解产物，2%的降解产物可完全抑制多种细菌的生长，认为-NH2和-COO-螯合了对微生物生长起关键作用的金属离子，从而抑制微生物的生长。黎军英等8的研究表明壳聚糖能引起桃褐腐病菌的超微结构破坏，主要表现为细胞壁的破坏，从而认为在壳聚糖存在时，病菌真菌的几丁质酶过度表达，导致对其自身细胞壁几丁质的降解，从而损伤细胞壁。壳聚糖能加速伤口愈合，研究发现9,10，壳聚糖可使创伤部位的嗜中性粒细胞和巨噬细胞活化，刺激花生四烯酸的释放，引导白细胞转移，从而加速邻近组织再生和血管形成，从而促进伤口愈合。此外，它能激活免疫系统，提高机体对传染病的抵抗力。雷朝亮等用壳聚糖灌胃处理小鼠11，发现小鼠的胸腺/脏体比、脾脏/脏体比有显著提高，能使细胞免疫、体液免疫、单核-巨噬细胞功能和自然杀伤细胞活性增强。壳聚糖调节免疫功能的机理12可能是通过调控诱导性NO合成酶的活性，影响免疫细胞NO的生成，或者通过调控磷脂酶A2的活性，影响免疫细胞花生四烯酸的生成，进而实现对免疫的调节功能。早期研究表明壳聚糖可以与脂肪及胆固醇结合，壳聚糖口服后，经胃酸的作用溶胀，并在小肠内形成凝胶，与脂肪、脂肪酸、胆固醇等物质结合形成不被吸收的凝集粒，通过粪便排出体外，起到降血脂和降胆固醇的作用。此外壳聚糖还能结合胆汁酸，降低体内胆汁酸水平，有利于血液中胆固醇向胆汁酸转化，使血液中胆固醇含量降低13。壳聚糖能够影响肠道pH环境，进而影响肠道菌落的构成。史彬林等12研究发现，在肉仔鸡日粮中添加壳聚糖时，引起盲肠内容物中乳酸杆菌数量呈增加趋势，而大肠杆菌数量正好相反。壳聚糖制品可做工业过滤材料, 用于净化、环保污水处理等。甲壳素和壳聚糖作为絮凝剂或吸附剂在废水处理中的应用研究取得了巨大的进展 14。低分子壳聚糖具有良好的成膜性和吸湿保湿性，成膜后具有良好的透气性，且壳聚糖分子本身的结构类似皮肤表层，带有正电荷，能与皮肤及毛发表面紧密结合，因此在化妆品领域中具有很高的应用价值。但是壳聚糖仅溶于稀酸性水溶液而不溶于水，其开发利用受到了很大程度的限制。因此，通过壳聚糖改性提高其水溶性成了壳聚糖研究中的一个热点。3 壳聚糖的衍生物及主要衍生物的性质壳聚糖及衍生物应用的领域目前已涉及医药、新材料、食品、农业、水处理、化妆品、造纸、纺织、印染等产业，前景十分广阔。甲壳素、壳聚糖以及降解产物寡糖和单糖作为天然无毒制品，由于分子量的不同赋予它们不同的理化性质和功能，由于糖单元带有-NH2和-OH功能基团，通过化学衍生化的分子设计，可衍生出不同性质、功能和用途的新产品，其衍生反应主要包括对甲壳素、壳聚糖进行羧甲基化、酰基化、季铵化、烷基化、硫酸及磷酸酯化、氰乙基化、羟基化等等。 4羧甲基化壳聚糖羧甲基壳聚糖是壳聚糖经过羧甲基化反应后制得的一种衍生物。壳聚糖分子中C6羟基、C3羟基和C2氨基均可发生羧甲基化取代，因此，控制反应条件可制备O-羧甲基壳聚糖、N-羧甲基壳聚糖和N，O-羧甲基壳聚糖三种产物。壳聚糖经羧甲基化改性后，提高了溶解性，具有良好的成膜性，增稠性，吸湿保湿性，絮凝性，螯合性等特性，广泛应用于医学，食品工业，农业，水处理工业和化妆品工业等领域。4. 1N- CMC的制备N-CMC的制备是Muzzarelli15、16首次提出，用乙醛酸与壳聚糖在pH4.5的条件下反应34h，得到不溶于碱溶液的产物，用NaBH3CN或NaBH4还原后，即成N-CMC。图1.6 N-CMC的合成路线Fig. 1.6 Synthesis of N-CMC醛、酮与胺在弱酸性的条件下发生羰胺缩合反应。氨基氮上的孤对电子进攻羰基碳，羰基的碳氧双键中的一个电子全给氧原子，生成一个碳四面体中间体。氧负原子再得到氢变成羟基， -NH2R失去H成为-NHR，接着羟基和 -NHR中的氢结合脱去一分子水，而形成碳氮双键，最后就形成了亚胺，即西佛碱。该反应为可逆反应，西佛碱经还原后可得到碳氮单键，形成稳定结构。壳聚糖糖单元的2位氨基，在弱酸性条件下被活化，可与醛基发生西佛碱产应，经还原后可得到N-衍生物。由于反应在弱酸性条件下进行，条件温和，可防止壳聚糖分子链因强酸强碱的作用而发生断裂。反应生成的N-CMC含有乙酰基、羧甲基和自由氨基基团，其比例取决于壳聚糖糖单元与乙醛酸摩尔比。4.2 N-CMC的应用价值由于CMC 具有优良的生物降解性、抗菌性、生物相容性，在生物医学领域的应用范围越来越广，其相关研究也越来越深入。刘万顺等17对CMC进行了毒理学研究，包括急性皮肤毒性、急性经口毒性，长期经口毒性实验，结果表明CMC为无毒性产品。庄昭霞等18通过细胞毒性试验、肌肉植入试验等体内外生物学实验相结合的方法研究CMC的生物相容性，表明CMC具有良好的生物相容性。N，O-CMC可用于防止术后组织粘连，由于其粘度和弹性大于血浆，可阻止血液在组织表面凝结从而起到防止伤口粘连的效果。Kennedy19研究了N，O-CMC对子宫膜和小肠破损模型的术后防粘连作用，发现N，O-CMC比透明质酸具有更好的防粘连效果。常菁等20发现甲壳素-羧甲基壳聚糖-羟丙基壳聚糖复合膜对成纤维细胞生长有较强的抑制作用，表明其具有潜在的防粘连作用。Muzzarelli等21制备了N,N-CMC与磷酸钙的复合物用作骨骼修复材料，在降解过程中释放钙离子，促进骨骼生长，在羊腿和人体牙修复实验中取得良好的效果。张永军等22将CMC应用于复杂下颌阻生智齿拔牙创中，研究表明，CMC具有明显的止血效果（P12时终止滴定。绘制pH值NaOH溶液体积曲线，利用微商法确定拐点处滴定碱液的用量。根据下面的公式计算羧化度：160VC（NaOH）羧化度（D.C.）%= 100M-82VC（NaOH）（公式2.3）（2）（3）（4） （5）（6） 其中：（7） V：N-CMC中羧基H+质子全部被碱中和所消耗氢氧化钠标准溶液的体积（L）；（8） M：样品质量（g）；（9） C（NaOH）：氢氧化钠标准溶液（0.0994mol/L）；（10） 82：-CH2C02Na相对分子量；（11） 160：壳聚糖中糖单元相对分子量。2.4N-CMC的分子量大小测定液相色谱法2.5N-CMC的粘度测定2.6N-CMC的水分测定3 结果与讨论3.1 N-CMC的制备经反应冷冻干燥得到白色状产物。经过多次合成、纯化得出：在合成时，要控制搅拌速度，乙醛酸、硼氢化钠的滴加速度，尽量缓慢的滴加硼氢化钠的速度会得到更理想的结果3.2 N-CMC的纯化将制备所得的N-CMC溶解过滤，除去不溶物，经冷冻干燥得到纯度较高的N-CMC，呈白色，部分略带黄色。纯化时，先要过纱绢，这样更利于后面实验，再依次过3、1.2、0.45、0.22um的混合纤维素酯微孔滤膜。3.4 N-CMC的羧化度测定羧化度测定3.4N-CMC的分子量大小测定3.5N-CMC的粘度测定3.6N-CMC的水分测定第三章、羧甲基壳聚糖对创伤修复的促进作用1 材料及仪器1.1材料及试剂生理盐水、N-CMC、福尔马林溶液、戊巴比妥酸钠、2%N-CMC1.2主要仪器磁力搅拌器2 实验部分2.1 动物的N-CMC皮刺2.2. N-CMC对皮肤创伤修复功能的研究 深度烫伤模型的制备：将去毛大鼠背部皮肤浸入85恒温水浴中，持续15s，造成深度烫伤，面积为5cm8cm，约是体表面积的10%。 术后定时敷用N-CMC凝胶，特定时段观察创面出血量和愈合创面局部特征；按Nagelschmidt法计算各时相点创面愈合率；以创面完全上皮化、无渗出作为创面完全愈合的依据，记录创面愈合时间；3 结果与讨论3.1动物的N-CMC皮刺3.2 N-CMC对皮肤创伤修复功能的研究第四章结论1 主要结论（1）以乙醛酸和壳聚糖为原料，制备了具有良好水溶性的N-羧甲基壳聚糖，随着还原时间的增加，得到水溶性更好的产品。（2）对N-CMC进行了物理性质的研究。液相色谱显示N-CMC的分子量在 。N-CMC的黏均分子量在120130KDa，滴定法测的N-CMC的羧化度为 等电点在pH 5附近。（3）将材料制备成膜片和胶体两种剂型，分别在大鼠肌肉和皮下进行组织相容性评价。结果显示， 2存在的不足与进一步研究计划（1） 得到N-CMC时，乙醛酸的消耗量比较大，需要进一步优化制备工艺，未对反应时间延长反而得不到可溶产物的原因进行分析；（2） 未对N-CMC的应用性进行进一步的研究。参考文献1 蒋挺大.甲壳素. 化学工业出版社.2005.5:12 HongKYoon No, Na young Park, Shin Ho Lee, et al. Antibacterial activity of chitosans and chitosan oligomers with different molecular weights. International Journal of Food Microbiology, 2002, 74: 65723 Tokura S, Ueno K, Miyazaki S, et al. Molecular weight Dependent Antimicrobial Activity of Chitosan. Macromolecular Symposia, 1997, 120:194 郑连英,朱江峰,孙昆山. 壳聚糖的抗菌性能研究.应用化学,2000,18(2):22445 I.M. Helander, E.L Nurmiaho-Lassila, R. Ahvenainen, et al. 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