分子生物学基础理论概要和常用实验技术简介

20110426,分子生物学基础理论概要和常用实验技术简介,报告主要内容,分子生物学概要几个分子生物学理论知识点常用分子生物学实验技术生物信息学简介,一、什么是分子生物学？二、分子生物学内容和原理三、主要的理论成就四、主要的应用成就五、技术进步,分子生物学概要,一、什么是分子生物学？ 从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。,分子生物学概要,核酸的分子生物学研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学研究执行各生命功能的主要分子蛋白质的结构与功能。信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。在一些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。,二、分子生物学内容和基本原理,基本原理： 构成生物体各类有机大分子的单体在不同生物中都是相同的。大分子建成规则相同。某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定 了它的属性。,三、主要的理论成就,1、DNA双螺旋模板学说2、遗传中心法则3、基因表达调控理论 （操纵子模型）4、基因学说的丰富和发展 （基因现代概念的确立）5、基因突变理论6、基因作图理论7、分子进化学说8、信号转导学说,9、细胞周期调控理论10、癌变的分子机制11、通用遗传密码字典与 非通用遗传密码字典12、生物信息学13、基因组学与比较基因 组学14、“RNA世界”假说15、细胞衰老和程序化死 亡机理,（1）已用基因工程的技术研制出了一批珍贵的基因工程药物： 人生长抑素 生产胰岛素 生产生长激素 生产组织型血纤维蛋白溶酶原激活因子 抗血友病因子 制备乙型肝炎疫苗 生产多种细胞因子 制备基因工程抗体,1、在医学上的应用成就,三、主要的理论成就,（2）基因诊断与基因治疗 疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异 性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、RFLP、 PCR、DNA指纹图谱 法医诊断、亲子鉴定 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染 受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体 进行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,（2）基因诊断与基因治疗 疾病诊断：遗传病、肿瘤、病毒感染的诊断，具有特异 性高，适应性强的特点，常用方法有核酸杂交、RFLP、 PCR、DNA指纹图谱 法医诊断、亲子鉴定 基因治疗：方法有将目的基因与逆转录病毒重组、转染 受体细胞，使之表达以弥补缺陷；将目的基因对染色体 进行定位整合，即基因打靶；裸DNA直接注射。,1.超离技术2.电泳技术3.电镜技术4.X衍射与核磁共振5.分子杂交技术(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文库7.PCR,8.DNA测序9.DNA化学合成10.载体构建11.染色体步查12.基因定点诱变13.基因打靶14.基因转移15.动物克隆,五、技术进步,五、技术进步,1.超离技术2.电泳技术3.电镜技术4.X衍射与核磁共振5.分子杂交技术(Southern/Northern/Western/FISH)6.基因克隆、基因文库7.PCR,8.DNA测序9.DNA化学合成10.载体构建11.染色体步查12.基因定点诱变13.基因打靶14.基因转移15.动物克隆,16.单克隆抗体17.基因工程抗体18.基因诊断19.基因治疗20.基因作图21.差异显示22.分子进化工程,23.分子辅助育种24.生物芯片25.DNA指纹26.酵母双杂交27.基因捕获28.RNAi29.基因敲除,相关基础分子生物学理论,一、基因及基因突变二、生物信息的传递（中心法则）三、真核基因的表达与调控,1、关于基因的概念,基因的概念随着遗传学、分子生物学、生物化学等领域的发展而不断完善。从遗传学的角度看，基因是生物的遗传物质，是遗传的基本单位突变单位、重组单位和功能单位；从分子生物学的角度看，基因是负载特定遗传信息的DNA分子片段，在一定条件下能够表达这种遗传信息，变成特定的生理功能。有的生物基因为RNA。,2、从分子水平来说，基因有三个基本特性：基因可自体复制；基因决定性状，即基因通过转录和翻译决定多肽链的氨基酸顺序，从而决定某种酶或蛋白质的性质，而最终表达为某一性状基因的突变，即基因虽很稳定，但也会发生突变。一般来说，新的突变的等位基因一旦形成，就可通过自体复制，在随后的细胞分裂中保留下来。,3、基因的功能类型,结构基因（structural gene）是可编码RNA或蛋白质的一段序列。结构基因的突变可导致特定蛋白质（或酶）一级结构的改变或影响蛋白质（或酶）量的改变。. 调控基因（regulator and control gene）是指其产物参与调控其他结构基因表达的基因。调控基因的突变可以影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）时的改变。.重叠基因（overlapping gene) 指同一段DNA的编码顺序，由于阅读框架的不同或终止早晚的不同，同时编码两个或两个以上多肽链的基因。 基因在染色体上可能有重叠，甚至一个基因完全存在于另一个基因内部。,断裂基因或隔裂基因（split gene),指一个结构基因内部为一个或者更多的不翻译的编码顺序。,外显子：参加蛋白质编码的DNA片段；内含子：不参加蛋白质编码的DNA片段。有的真核生物基因可能是不同外显子的组合断裂基因。,真核生物基因的典型结构,跳跃基因(jumping gene)又称为转座(transposon)、转座因子、转位因子(transposable element)，指可作为插入因子和转座因子移动的DNA序列。假基因（pseudogene），同已知的基因相似，但位于不同位点，因缺失或突变而不能转绿或翻译，是没有功能的基因。,基因突变(gene mutation)：染色体上某一基因位点内部发生了化学性质(结构)的变化，与原来基因形成对性关系。例如：植物高秆基因D突变为矮秆基因d。经典遗传学认为：基因是一个“点”，在染色体上具有一定的位置和相互排列关系。而基因突变就是一个点的改变，是以一个整体进行突变。因此从经典遗传学水平看，基因突变又称为“点突变”(point mutation)。locus与site现代基因概念认为：基因是DNA分子带有遗传信息的碱基序列；基因是由众多碱基对构成，此时将一个碱基对称为基因的一个座位(site)；基因在染色体上的位置则称为位点(locus)。,4、基因突变,人的自然突变频率为： 110-4110-6。,5、 基因突变的类型,根据基因结构的改变方式：碱基替换突变；碱基倒位；移码(插入与缺失)突变,根据突变所引起的表型改变分为：形态突变型；生化突变型；致死突变型；条件致死突变型,从DNA碱基序列改变的多少：单点突变(替换)；与经典遗传学的点突变point mutation比较.多点突变(移码)。,从突变所引起的遗传信息意义的改变： 错义突变（missense mutation）:是指DNA分子中碱基改变后引起密码子变化。导致所编码的氨基酸发生替代，从而影响蛋白质功能，以至影响到突变体的表型。无义突变（nonsense mutation）:是指由于DNA的碱基改变导致编码氨基酸的密码子突变成终止密码子。引起mRNA 翻译提前终止，产生一条短的不完整的多肽链。无义突变通常对所编码的蛋白活性有严重影响。,同义突变(沉默突变 silent mutation）:是指DNA分子中的碱基改变后，突变的密码子仍然编码原来的氨基酸，并没有引起多肽链中氨基酸的变化。不会引起表型突变，它们以多态的形式在生物体DNA中积累，引起同种生物不同个体间DNA序列的变化。延长肽链突变： 终止密码子突变成氨基酸的密码子。,1、中心法则及其发展,中心法则(central dogma)阐述生物世代、个体以及从遗传物质到性状的遗传信息流向，即遗传信息在遗传物质复制、性状表现过程中的信息流向。最初由Crick提出，并经过了多次修正。,反转录(逆转录)：反转录酶；cDNA。RNA的自我复制。DNA指导蛋白质合成。,2、遗传密码及其特性,三联性；非重叠性；连续性；简并性；有序性；通用性。,遗传密码的基本特性：,起始密码子与终止密码子：起始密码子：AUG(甲硫氨酸/甲酰甲硫氨酸)；终止密码子(无义密码子)：UAA(赭石)、UAG(琥珀)、UGA(蛋白石)。通用性的另外情况：,2、遗传密码及其特性,三、真核基因的表达调控,诱发基因转录的信号、基因调控在哪一步(模板DNA的转录、mRNA的成熟或蛋白质合成) 实现不同水平基因调控的分子机制是研究基因调控的三个主要内容。,a DNA水平的基因表达调控 b 转录水平的基因表达调控 c 转录产物的加工转运调控 d 翻译水平的基因表达调控,三个主要内容：,1. 真核生物基因组结构特点,（1）基因组大，基因多，存在大量重复序列，大部分与组蛋白和非组蛋白结合在一起；（2）基因主要以单顺反子形式存在；（3）多数基因是断裂的；（4）存在基因家族；（5）基因表达的调控位点多，位置多样化；（6）部分基因组序列存在重排、扩增、丢失等规律性变化。,2 转录水平的基因表达调控,2.1 顺式作用元件2.2 反式作用因子 2.3 真核基因转录调控的主要模式,2.1 顺式作用元件,2.1.1 基本概念2.1.2 顺式作用元件的分类,2.1.1 基本概念,顺式作用元件(cis-acting elements) 基因周围能与特异转录因子结合而影响基因转录的DNA序列。顺式作用(cis-acting ) 顺式作用元件对基因表达起调控作用的过程。,2.1.2 顺式作用元件的分类,（1）启动子（2）增强子（3）绝缘子（4）转座子（5）其他应答元件,（1）启动子(Promoter), 定义 作用特点 作用机制 分类, 定义 位于转录起始点附近且为转录起始所必需的DNA序列。 作用特点 一个基因可同时拥有一个及以上启动子； 位置不定，一般在转录起始点上游； 可与增强子共同控制转录起始和强度； 发挥功能时除需RNA聚合酶外，还需转录调控因子与启动子区各种调控元件相互作用。, 作用机制 通过直接与RNA聚合酶相互作用，或结合于启动子关键元件上的蛋白质因子与RNA聚合酶的直接或间接作用，使得RNA聚酶处于适于转录起始的位置，从而利于转录起始。 分类 细胞特异启动子 诱导型启动子 通用启动子,（2）增强子(enhancer), 定义 作用特点 作用机制 分类, 定义 指位于离转录起始点较远位置上，具有参与激活和增强起始功能的序列元件。 作用特点 增强效应显著； 增强效应与其位置和取向无关； 要有启动子才能发挥作用； 须与特定蛋白质因子结合才能发挥作用； 一般具有组织或细胞特异性； 无基因专一性。, 增强子的作用机制 通过提高启动子附近激活剂浓度而起作用。当它被约束在启动子附近时，可在任何位置起作用。 三种可能的作用方式： 可影响模板附近的DNA双螺旋结构； 将模板固定在细胞核内特定位置； 增强子区可以作为反式作用因子或RNA聚合酶进入染色质特定结构的入口。 增强子的种类 细胞特异性增强子 诱导性增强子 通用增强子,一种负调控元件，参与基因表达的负调控。其作用可不受序列方向影响，能远距离发挥作用。,（3）绝缘子(Insulator),（4）转座子（transposon）,能将自己插入基因组中新的位置的DNA序列。,反式作用因子(trans-acting factor) 一种基因的RNA或蛋白质产物，能影响位于基因组另一条染色体上的（或基因组别处的）另一个基因的活性。反式作用(trans-acting) 反式作用因子对基因表达起调控作用的过程。,2.2.1 基本概念,2.2.2 转录因子的类型,（1）基本转录因子(Basal factor) 和RNA聚合酶一起结合于转录起始点和TATA盒；（2）激活剂(activator) 特异性识别短共有序列元件的转录因子。结合于启动子或增强子位点上。通过增加基本转录复合体(basal apparatus) 结合于启动子的效率而起作用；（3）辅激活剂(coactivator) 连接了激活剂和基本转录复合体；（4）一些调节因子(Some regulators) 可使染色质结构改变。,2.3 真核基因转录调控的模式,2.3.1 RNA聚合酶的启动子和转录因子2.3.2 RNA聚合酶的启动子和转录因子2.3.3 RNA聚合酶 的启动子和转录因子,真核细胞细胞核中共有3类RNA聚合酶,RNA聚合酶的启动子由一个核心启动子 (core promoter) 和一个上游控制元件 (upstream control element, UCE) 组成。,2.3.1 RNA聚合酶的启动子和转录因子,2.3.2 RNA聚合酶的启动子和转录因子,RNA聚合酶识别的启动子分为两类： 5S RNA和tRNA基因的启动子位于基因内部(起始点下游)，称内部启动子(internal promoter) ； 核小RNA（snRNA）基因的启动子则位于起始点上游，与其他常规启动子的作用方式相同。,2.3.3 RNA聚合酶 的启动子和转录因子,RNA聚合酶的启动子结构复杂，且序列变化很大，与转录启动有关的位点包括4个部位： 帽子位点（转录起始点），其碱基大多为A； -25附近的TATA框； -75附近的CAAT框； -100以上的远上游序列，即增强子。 转录要起始，需很多的转录因子参与。,3 转录产物的加工转运调控,3.1 RNA的不同剪接和编辑使同一基因转录产生出不同的蛋白质3.2 RNA的切割和加polyA改变基因编码的蛋白质3.3 RNA从核中转运到细胞质的过程受控制,基因操作也称重组DNA技术，主要包括DNA分子的切割与连接、细胞转化、凝胶电泳、核酸分子杂交、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入各种载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之进入新的寄主细胞内，进行持续稳定的繁殖和表达。,常用分子生物学实验技术,两个概念,主要内容,一、 重组DNA技术二、DNA的基本操作三、 RNA的提取和反转录,一、什么是重组DNA技术？,1、重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）,又称为基因克隆（Gene Cloning）或分子克隆（Molecular Cloning）技术。是按照人们意愿，在体外对DNA分子进行重组，再将重组分子导入受体细胞，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得该DNA的大量拷贝。,重组DNA技术包括了一系列的基因操作步骤。,2、重组DNA技术的基本步骤,目的DNA的获得与载体的制备；目的DNA与载体的连接；重组DNA导入受体细胞；重组DNA的筛选和鉴定；目的DNA的表达及表达产物的检测与分离纯化。,3、载体应当具备的条件,（1）能自主复制。容易获得大量的重组的DNA分子；（2）具有合适的外源DNA插入的位点（克隆位点或限制性内切酶的切点）。便于接纳不同的DNA片段。（3）具备可供选择的遗传标记。便于进行重组体筛选和鉴定。（4）载体本身应尽量小。不含或尽量少含多余的DNA部分，这样可以容纳较大的外源DNA。（5）在宿主细胞内的稳定性高。,多克隆位点,Ori,复制起始点,遗传标记,Amp,MCS,载体,4、工具酶,我们的基本目的是：把外源基因与载体连接在一起形成重组DNA分子，最少需要以下两类工具酶：,、准确切割DNA分子的工具（“分子手术刀”） -限制性内切酶,、DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） -DNA连接酶,、限制性核酸内切酶- “分子手术刀”,限制性核酸内切酶（Restriction Endonuclease, RE）： 是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基顺序的核酸水解酶。,分类:I、II、III（重组DNA技术中常用II型）,识别序列特点 回文结构(palindrome) 即反向重复结构，以DNA分子中某一处为轴，其两侧核苷酸排列呈回文对称的序列。,每种限制性内切酶都有一个它所识别、结合并切割的特异序列，称为限制性位点或切点（48bp）。,识别序列：,Bam H,+,Sam I,+,平末端（Blunt end）：对称轴切割,粘性末端（Sticky end）：交错切割,切口：平端切口、粘端切口,几个常用限制性内切酶及其切点,、DNA连接酶- “分子缝合针”,DNA连接酶（DNA Ligase）： 催化两条DNA链的3-OH和5-P之间形成磷酸二酯键而把两个DNA分子连接在一起。例如:T4 DNA连接酶。,外源基因与载体的连接方式：,（1）粘性末端连接,方式： 同一限制性内切酶切点的连接 不同限制性内切酶切点的连接,（2）平端连接,适用于： 限制性内切酶作用产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端,（四）宿主细胞,大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞,1、常用种类,2、导入方式,转化（transformation）转染（transfection）转导（transduction）,DNA的基本操作技术,（Techniques for DNA Manipulation）,一、核酸的凝胶电泳,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖,一、核酸的凝胶电泳,核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进行分离。因此，可用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术基础。,一、核酸的凝胶电泳,核酸凝胶电泳是重组DNA技术的核心技术之一，它可以按分子量大小对DNA或RNA进行分离。因此，可用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术的技术基础。,常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。,琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50 kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1, 000 bp之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力,二、细菌转化与目标DNA分子的增殖,细菌转化（Transformation）:,一种细菌菌株由于捕获了外源DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。,绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的DNA。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得DNA的能力。经历这种处理的细胞被称为感受态细胞（Competent Cell）。,常用细菌转化的方法1-CaCl2法,将快速生长中的大肠杆菌置于经(0）预处理的低渗氯化钙(0.1mol/L)溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源DNA粘附在细胞表面。,42下做短暂热刺激，细胞吸收外源DNA。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。,常用细菌转化的方法2-电转化法,利用锐利的电脉冲在细胞膜上造成小凹陷，进而形成纳米级疏水孔洞。随着跨膜电压增加，一些较大的疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞，溶液中的DNA很容易通过孔洞进入细胞质。,克隆的筛选和鉴定：,1、抗生素,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,2、-互补蓝白斑筛选法,实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,载体上：-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基 端（N端）146个氨基酸编码序列，在编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）； - 片段,宿主细胞：编码-半乳糖苷酶C端序列 - 片段,宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，LacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。,细菌转化与目标DNA分子的增殖的操作过程,三、RNA的提取和反转录,RNA存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用RNA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。 由于当前没有一种方法能够直接扩增RNA，为了研究RNA所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的DNA双螺旋（Complementary DNA，cDNA)，再插入到可以自我复制的载体中。由于cDNA来自RNA，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。,1、 总RNA的提取,细胞中的总RNA包括信使RNA (mRNA) 、核糖体RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)以及一些非编码的小RNA 。一个典型的动物细胞约含有10-5g RNA，其中rRNA占80%85%，tRNA和非编码小RNA占15%20% ， mRNA 占1%5%。,按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍-苯酚法。 Trizol试剂是使用最广泛的抽提RNA专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来，并使蛋白质与RNA分子分离，还能保证RNA的完整性。,常用的RNA提取方法,、常用提取方法的种类,由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要。,、注意事项,纯的RNA样品其OD260OD280应介于1.8-2.0之间。 1）若RNA样品OD260/OD280比值太小，说明有蛋白质或酚的污染； 2）比值大于2.0时，可能被异硫氰酸胍等污染； OD260值=1，相当于单链DNA或RNA为40g/mL，寡核苷酸为20g/mL。,RNA的纯度、浓度与完整性,1、RNA的纯度,2、RNA的浓度,rRNA大小完整，而且28S rRNA和 18S rRNA亮度接近2：1；mRNA分布均匀，则认为RNA质量较好。,3、RNA的完整性,2、 cDNA的合成,使用Oligo dT Primer时的cDNA合成,使用Random Primer时的cDNA合成,缺陷：不具有ploy（A）尾结构的mRNA无法使用此方法！,生物信息学简介,概念：生物信息学是用数理和信息科学的观点、理论和方法去研究生命现象、组织和分析呈现指数增长的生物学数据的一门学科。,首先是研究遗传物质的载体DNA及其编码的大分子蛋白质，以计算机为其主要工具，发展各种软件，对逐日增长的浩如烟海的DNA和蛋白质的序列和结构进行收集、整理、分析和研究，逐步认识生命的起源、进化、遗传和发育的本质，破译隐藏在DNA序列中的遗传语言，揭示人体生理和病理过程的分子基础，为人类疾病的预测、诊断、预防和治疗提供最合理和有效的途径。生物信息学已经成为生物医学、农学、遗传学、细胞生物学等学科发展的强大推动力量，也是药物设计、环境监测的重要组成部分。,1、美国国家信息中心 (National Center of Biotechnology Information, NCBI)的Gen Bank(http:/ / www. nchi. nlm. nih. gov/ web/Gen Bank/ imdex. html)2、欧洲分子生物学室验室(European Molecular Biology L aboratory-Euro-pean Bioinformatics Inst