第三章 中药药效学研究的基本要求与方法.doc

.第三章 中药药效学研究的基本要求与方法第一节 中药药效学研究的基本要求中药新药的基本要求是安全、有效、质量可控和稳定。药效学是中药新药研究与开发的重要内容。一.药效学研究的基本目的（一）通过药效学研究确定有效性通过药效学研究可以初步明确新药是否有效，作用的强弱，与同类药比较在药效上的优缺点和特色，确定有无实用价值及开发前景，结合毒理学研究结果，确定可否进行人体试验及临床研究。（二）提高临床疗效通过作用机制研究及配伍规律研究，可以揭示药物作用的物质基础和作用原理，使临床使用充分发挥药物特色，提高临床疗效。中药新药的药效学研究应充分运用现代科学特别是现代医学的理论、方法和手段，制定科学、严密、具有中医药特点的试验计划。根据新药的特点、功能主治、临床实践经验及近年研究成果，合理选用试验方法，建立与临床相符的 “病” “症”或“证”相似的动物模型与指标，对新药的有效性作出科学的评价。对天然药物及中药中提出的单一化合物不强求用中医药理论来指导二.药效学基本要求（一）试验负责人 应是具有药理、毒理专业高级职称和有较高理论水平、工作经验与资历的人员。确保试验设计合理，数据可靠，结论判断准确。试验报告应有试验负责人签名及单位盖章。（二）受试药物 应处方固定、制备工艺及质量基本稳定。（三）研究单位从事新药安全性研究和药理研究的实验室应符合国家药品非临床研究质量管理规范GLP (Good Laboratory Practice)的要求。具有较高的科研水平、技术实力，组织管理，具有较好的客观条件，其实验室、仪器设备、药品试剂等，均应符合要求。（四）实验动物 应符合国家规定的要求，种属、性别、年龄、健康状况、饲养条件、动物等级、特殊模型动物等，均应符合试验要求。（五）试验记录 1.记录要求：实验记录应真实、完整、详细、准确、规范，防止漏记和随意涂改，对试验中出现的新问题和特殊现象应详细写明情况。描记和形态学检查应有记录图和照片。不得伪造、编造数据。记录应符合国家药品研究实验记录暂行规定的要求。2.记录内容：实验名称：每项实验首先记录课题名称及实验名称。实验方案：实验方案是进行实验的依据。实验首页应有一份详细的实验设计及方案。实验日期：每次实验须记下年、月、日及时间。试验动物：种属、性别、年龄、数量、健康状况、提供单位、合格证，动物等级或特殊模型动物、饲养管理、试验前观察与处理，随机分组的方法。试验用药：品种、学名、产地，提取工艺，药物含量、浓度，给药剂量与容积，给药途径、次数、时间。阳性对照药的选择依据、处方、功能主治，生产厂家名称，批准文号，生产批号及出厂日期，实验前预处理，有无特殊溶媒、基质、防腐剂、助溶剂、填加剂等。试验用其他药品试剂的品名、规格、生产厂家、批号等。主要仪器及试验用品：型号、规格、性能、生产厂家及批号等。试验方法：说明参考文献的来源，主要操作程序(动物麻醉、固定、手术、观测等)，观测指标(取样、测试、记录、计算、统计等)，以及每只动物的原始记录、数据、图谱等，各组原始数据的统计、分析、比较结果。试验结果：制表、绘图，分析判断，获得准确可靠的结论等。试验记录应准确无误，不得任意取舍或涂改，试验中出现的特殊现象、矛盾结果等，均应详细记录。 此外，实验室的温度、湿度(必要时气压)，实验的时间(必要时注明白日或黑夜)，以及可能影响试验的环境因素，均应详细记录。 实验负责人、参加者、单位等亦应记录。所有试验记录，均应妥善保存，保管人姓名、单位。随时准备上级检查。（六）统计处理 试验结果应进行正确的统计学处理，统计方法应说明。数据表格应规范。资料整理应简明扼要，注意科学性、严密性、逻辑性，真实可靠地反映出试验所获得的各种信息与结果。第二节 药效学研究的方法一.实验设计原则 实验设计应该符合中药特点；符合国家新药研究申报的有关规定；遵守“随机、对照、重复”的原则。二.动物选择 1.种类：动物选择敏感动物，对药物的反应与人体近似，以进化程度较高，解剖、生理、习性及反应性与人相近的动物为佳。能够大量繁殖供应，价格便宜的动物。灵长类动物（猴、猩猩）最近似人类，但价格昂贵、难得、需特殊饲养。实验常用小鼠和大鼠，易繁殖和饲养、价廉、耗药量少。豚鼠易于致敏，对组胺非常敏感，适于做过敏试验。家兔对体温变化十分灵敏，常用于热源检查和解热试验。猫、狗、大鼠血压稳定，常作为血压试验。大鼠和狗常于毒理学研究。猪由于解剖和生理上与人相似，近日选用逐渐增多。 2.品系：不同品系动物对药物的敏感性不一。例如A、C3H、津白小鼠易致癌，AKR、DBA/2、L615易致白血病，C3H雌鼠乳腺癌自发率达90%，AKR小鼠白血病自发率达65%。目前最常用动物为昆明种小鼠，Wistar大鼠、SD（Sprague Dawley）大鼠、青紫蓝兔、新西兰兔和日本大白兔、豚鼠等。3.动物等级：实验动物应选用符合等级要求的健康动物，并有供应单位合格证。我国将实验动物分为4级：一级动物即普通动物（CV）；二级动物即清洁动物（CL）；三级动物即无特定病原体动物（SPF）；四级动物即无菌动物（GF）和悉生动物（GN）。目前我国药理学实验大多采用普通级动物（CV动物）和清洁级动物（CL动物）。4.年龄：常用性成熟年龄动物，小鼠为68周龄，大鼠89周龄，豚鼠610周龄，兔45月，猫68月，狗68月。常选用成年小鼠体重为1822g，大鼠200g（150250g），家兔2kg（1.52.5kg），猫23kg，狗810kg，猴815kg。必要时选用特定年龄、体重动物。5.性别：一般试验选用雌雄各半动物。某些试验选一个性别动物。例如热板法镇痛试验选用雌性小鼠，而不用雄性小鼠。6.数量：每组试验动物数应符合统计学要求。药效学计量学统计试验每组试验动物，一般小鼠不得少于10只，大鼠为8只，猫、狗为4只以上，以便进行统计学处理。用小鼠、大鼠计数资料试验动物数则要求更多。 三.方法的选择 根据主治，参考功能，选择相应试验方法。针对性强、重点突出、主次分明。既可对新药有效性作出科学、准确的评价，又可避免走弯路，免作大量无关的或不说明问题的试验，减少大量人力物力及时间的浪费。由于中药常具有多方面的药效或通过多种方式发挥作用等特点，应选择相应的方法证实其药效。在选择试验方法时，应注意以下问题： （一）根据主治，参考功能，选择试验方法根据主治，参考功能，选择试验方法，这是适用于多数中药的基本经验。个别情况下也可根据功能选择试验方法。但要注意，目的性明确、针对性强，避免盲目选作大量无关或关系不大的试验，劳而无功。（二）首选具有中药特点的试验方法及动物模型首选符合中医理论，具有中药特点的试验方法及动物模型，其次可选用现代医药学合适的方法及模型。（三）主要药效为主，配合辅助试验直接证实主要药效的核心试验(或主要试验)为必作项目，可选作不同模型、方法、动物及给药途径的试验23项。而间接证实主要药效或次要治疗作用的外围试验(或辅助试验)为选作项目，可根据新药的特点，功能主治及已有的临床经验，酌情选作几个方面的药效试验，每个方面选作12项试验即可。一般情况下，绝大多数药物应以核心试验为主，是评价新药有效性的主要根据，适当配合辅助试验，有助于全面、准确的评价其有效性，但不可用外围试验取代核心试验。（四）试验方法的选择试验方法的选择应强调科学性、先进性、重复性、目的性，必须有针对性的精选试验，不可盲目的以多取胜。（五）整体和离体方法选择中药由于成分复杂，特别是复方粗制剂，为多种化学成分(或有效部位)的混合体，除有效成分外，尚有一些无关成分及干扰成分。如无特殊情况，给药途径应与临床给药途径尽量一致。中药粗制剂药效学试验应以体内试验为主，体外试验为辅，以消化道给药为主，其他给药途径为辅。 四.指标的选择 选择符合要求的观测指标，才能反映出药物对机体的影响，进行新药有效性的评价。指标符合以下要求：（一）特异性强 任何试验都应选用针对性强，专属性好，能够反映变化本质及主要药效的指标。（二）敏感性高 指标要敏感，对于病情及症候的任何变化，对于药物的防治作用，能够敏感、准确的反应出来。而敏感性差的指标，往往会遗漏某些阳性变化，而造成假阴性结果。（三）重现性好 指标要稳定，重现性好，结果才可靠。若重现性差，则应检查是动物不合要求，模型不合理，方法不可靠，还是观测指标有问题，检测记录不准确，误差太大，或是干扰因素太多等原因所致。否则，重现性差的试验结果不可靠，不能作为新药有效性评价的依据。（四）客观性 主观检测的指标，误差较大，不够准确，例如肉眼观测血压计水银柱的变化，误差较大，而用描记仪直接描记血压曲线，客观的、动态的记录血压变化，则更为精确。（五）定量指标 为了准确判断药物的作用及机体的变化，必须有量的概念、量的比较，必须选用可测量的定量指标(即计量指标)。例如形态学指标(如组织学、病理学指标)，其特点是能够准确的定性、定位，但难于定量，常需采用定量组织学方法，使之定量或半定量，更准确的判断药物的作用及机体的反应。但有些质反应指标只能反映是与否、死与不死、阴性与阳性，只能用计数指标。也有的指标目前尚无计量方法，可用分级定度打分的办法，使之定量化。（六）多指标综合运用各种指标均有其优点，也常有其局限性，或不足之处，一项观测指标很难满足上述多方面的要求。为了准确、全面地判断新药的有效性，常需多指标综合运用，以取长补短，相辅为用，例如生理指标可定性定量，进行连续动态观察，但有时定位欠准，可受多种因素干扰，稳定性较差。而形态学指标，则可定性定位，但难于定量，也难于进行连续的动态观测。各有优缺点，若生理、生化、形态等各类指标合理搭配，综合运用，则试验结果更为全面、准确、可靠。有些指标单一使用即可达到试验目的，满足要求，则不必为“多而全”而勉强采用多指标观测。应具体情况具体分析，根据试验目的与要求，优选指标，不是“越多越好”，而是“越说明问题越好”。五.药物的要求 供试药物是药效学研究的对象，是新药有效性评价的物质基础。供试药物不合要求，各项试验无法获得正确结果。因此，供试药物，应处方固定，各味药材经过品种鉴定，生产工艺基本定型，质量标准及稳定性试验基本符合要求，与临床用药基本相同的剂型与质量。凡是药材未经鉴定，处方、生产工艺、质量、剂型等尚未固定，或有变动者，不宜用作药效学试验。 消化道给药：包括灌胃、胃管、十二指肠给药等，可用制剂或提取物进行药效学试验。前者与临床用药更为相似，更合理，但因制剂含有大量糊精、蔗糖等赋型剂，水溶后呈粘稠状，灌胃不便，且体积大，含药量低，无法浓缩提高含药量，因而难于提高动物用量。所以在较多情况下，常用中药提取物进行试验。两者各有利弊，可依具体情况而定。 注射给药及试管内给药：对供试药物要求较高，应是化学纯品或精制的中药制剂，尽量除去杂质、不溶成分及无关成分，其溶解性、粒度、渗透压、酸碱度、无机离子含量(钠、钾、钙、镁等)以及可能干扰试验结果的各种因素，均应控制在生理范围内或符合注射剂基本要求。否则，注射给药将引起机体非特异性反应，产生一系列假象，误认为药理作用：试管内给药也会出现假阳性结果，造成错误判断，其结果须认真分析，慎重判断，且仅能供参考，不能作为新药有效性评价的主要根据。 外用药：包括擦剂、洗剂、贴剂、膏药等。一类是用于治疗体表或局部疾患，如皮肤病、疖肿、跌打损伤或局部肿痛、骨折等；另一类则是局部用药治疗全身性疾患，例如局部或穴位贴药治疗哮喘、冠心病、高血压等，两者用药目的不同，试验方法及给药方式也不完全相同。两者均可用制剂(含基质的成品)或中药提取物(不含基质的半成品)进行试验，以外用给药的方式为主，可依涂药面积大小，或含药浓度高低，或给药次数多少等方式，设立高、中、低给药剂量组。“内病外治者”，外用药应进行透皮吸收试验，以了解药物渗透吸收的速度与数量，有助于准确评价其药效。可以口服的复方中药，改为内病外治，应与口服进行药效学对照比较。外用药以制剂进行试验者，若制剂中含有特殊溶媒或基质者，除设空白对照外，尚应设溶媒或基质对照，以了解其作用和对主要药效的影响。 其他：眼、耳、鼻、吸入剂及腔道内给药(如直肠、阴道、气管内、腹腔、胸腔等)对药物也有严格要求，特别是气雾剂、吸入剂及腔道内给药，供试药物的要求基本与注射剂相同。六.给药途径与容量给药途径：给药途径应与临床相同。例如口服制剂动物可采用灌胃、十二指肠给药。如有困难可选用其他给药途径进行试验，但应该说明原因。有时动物试验采用临床相同的给药途径，无法作出结果，或确有困难者，可根据具体情况采用相似的其他给药途径进行试验。例如口服药进行心脏血流动力学试验难于显示结果，可改用注射给药(粗制剂可适当精制后，皮下、肌肉或腹腔注入，不宜静脉给药，除非供试药物符合注射剂要求)。又如用大鼠或小鼠进行连续多次或长期静脉注射或静脉输注给药时，困难较大，可酌情改用皮下、肌肉或腹腔注射(有刺激性者不宜进行腹腔注射)，或换用大动物(犬、猴等)进行试验。凡是因特殊情况采用不同于临床用药的给药途径进行试验时，应认真分析试验结果，排除可能存在的干扰因素及假象，充分估计不同给药途径可能产生的影响，正确判断试验结果，或其结果仅供参考，不能作为新药有效性评价的主要根据。给药容量：根据用药剂量而定。但应当适宜。容量过大、过小都不适宜，易出现实验误差甚至假阳性或动物死亡。禁食不禁水1216小时，小鼠每次常用灌胃（ig）容量0.1-0.2ml/10g体重，不超过0.4ml/10g体重，最大为1ml/只（禁食不禁水1216小时）；皮下（sc）、腹腔（ip）、静脉注射（iv）不超过0.5ml/只。大鼠禁食不禁水1216小时，每次灌胃容量一般为12 ml/100g（体重），最大般不超过5 ml/只；腹腔注射1.5ml/只；皮下和静脉注射不超过1ml/只；肌肉注射0.4ml/只。兔和猫最大容量：灌胃20ml/只，皮下、肌内注射2ml/只，腹腔注射5ml/只，静脉注射10 ml/只。七.试验组给药剂量 各种试验至少设3个剂量组，剂量选择应合理，尽量反映量效和或时效关系。大动物(猴、狗等)试验或特殊情况下，可适当减少剂量组。剂量选择应合理，剂量偏低难于显示药效；剂量过高，甚至超过毒理试验剂量，其试验结果没有意义，甚至是中毒效应被误认为治疗作用。可参考以下方式选择给药剂量。（一）根据半数致死量(LD50)计算凡是能够测出LD50者，可用其1/10、1/20、1/30、1/40等相近剂量，作为药效学试验的高中低剂量组。（二）根据临床用量计算凡有长期大量临床用药经验者，可根据人用量的数倍至几十倍，用作动物试验剂量，可根据人用剂量按公斤体重（g或mg生药/kg体重）来折箅动物用量。其粗略的等效倍数为1（人）、3（狗、猴）、5（猫、兔）、7（大鼠、豚鼠）、1011（小鼠）。例如大鼠的一个剂量可选用相当于临床剂量的37倍(小鼠可10-15倍)，而高剂量一般应低于长毒试验的低剂量。（三）根据文献估计剂量文献中相似药物的用量，若处方相似，提取工艺相似，可作为参考，估计出供试药的合理剂量范围。（四）根据体表面积估计剂量对一些安全系数小的药物，如抗癌药、强心苷等药物按体表面积计算动物用量。即所谓临床“等效”剂量，指根据体表面积折算法换算的同等体表面积（m2、cm2）单位时的剂量。这种方法计算比较麻烦，且合理性是相对的，因为动物和人的耐受性、反应性不尽相同。不论以何种方法选用的给药剂量，都应该通过预试，摸索到出现药理效应的适当剂量，再确定正式试验剂量。八.给药方式 根据药物特点及试验要求，可采用预防性给药(即先给药若干天或若干次，使药物在动物体内达到有效浓度后再造模型)观察药物的保护作用：或用治疗性给药(即先造成动物病理模型，然后给药)观察药物的治疗作用。后者符合临床实际情况，更为合理，各项试验(特别是核心试验)应尽量采用治疗性给药。但有些中药起效慢，作用缓和，需提前给药，多次给药，或连续数日给药，才能在动物试验显示药效，而一次性给药或造模型后给药，短时间内观察结果者，常难获得预期结果，只能采用预防性给药进行保护试验。两种给药方式，以治疗性给药为主，部分试验可根据需要采用预防性给药，