动物实验基本操作

动物实验的基本操作和操作技术,刘承武,第一节 常用的实验动物,实验动物？是指经人工饲育，对其携带的微生物、寄生虫实行控制，遗传背景明确或来源清楚的，用于科学研究、教学、鉴定及其他科学实验的动物。,实验动物必须具备4个条件：？敏感性均一性易获得性稳定性,动物实验：？是以实验动物为实验对象的科学实验，包括以实验动物整体水平或实验动物局部器官及系统（离体）的实验。影响动物实验结果准确性的因素？与实验动物的选择、实验条件、实验技术及方法有直接的关系-熟练的技术是实验成功的基础,实验动物的种类,常用的有青蛙（ frog）和蟾蜍（toad）鸟类（birds）小白鼠（mouse）大白鼠（rat）豚鼠（guinea pig）家兔（rabbit）猫（cat）和犬（dog），等。,青蛙与蟾蜍（Frog and Toad）,青蛙与蟾蜍属两栖动物，其一些基本生命活动与哺乳动物近似，其离体组织和器官所需的生理环境比较简单 (无须供氧和恒温)。 青蛙与蟾蜍常用于神经生理、肌肉生理、心脏生理，微循环等实验。,特点和应用：离体心脏能较持久地有节律地搏动，常用于观察药物对心脏的作用；坐骨神经和腓肠肌标本可用来观察药物对周围神经、神经肌肉或横纹肌的作用；肠系膜血管微循环实验等。,鸟类,鸡：如离体心脏实验、肺炎实验、心血管动脉粥样硬化实验等。鸭：乙型肝炎实验。鸽：心血管动脉粥样硬化实验、呕吐实验。鹌鹑（quail）：,小白鼠（Mouse ),是医学实验中用途最广泛和最常用动物。有多种品种。,习性？易大量繁殖，广泛用于医学科学实验。适用需要大量动物的实验，被广泛用于生物学、医学、兽医学、生理学、遗传学、药理、毒理、肿瘤、放射性、食品、生物制品等的科研、生产和教学。如药物筛选、半数致死量测定、抗感染、抗肿瘤药物及避孕药物的研究等，以及镇咳药实验、免疫学实验，等。,大鼠（Rat ),有多种品种。习性：喜欢啃咬，攻击性强、群居，昼伏夜动。对新环境适宜性强，行为表现多样，易接受通过强化进行的多种感觉指令的训练。体积较小鼠大，易于复制多种病理学模型。,大鼠应用于生理学、药理学、免疫学，内分泌学、神经生理、营养学、传染病、肿瘤和肝外科等的研究。也是医学及药学实验中常用的动物，如血压实验（抗高血压药物实验）、胆管插管，或用大白鼠观察药物的长期毒性、 行为学、消化系统等方面的实验。一些在小白鼠身上不便进行的实验可选用大白鼠，如抗炎实验中关节炎模型的制备。,豚鼠（Guinea pig ),习性：温顺胆小，喜欢群居和干燥清洁，好动但不善跳跃，草食性，听觉敏感喜叫。主要特点和应用：对组胺敏感，常用于平喘药、抗组胺药的实验和皮肤毒理学的实验,亦常用语急性高钾血症模型的实验。免疫学中血液可提供补体。,家兔(Rabbit ),习性：温顺胆小，喜欢独居和干燥清洁，草食性主要特点：体温调节稳定,家兔也是实验生理科学教学实验中最常用的动物。发热实验及热原实验、免疫学实验、心血管实验、生殖实验、眼科实验、皮肤实验等。,犬(Dog ),在以犬为实验动物的研究成果中，只有应用Beagle 才能被国际公认。,常用于观察药物对心脏泵功能和血流动力学的影响，心肌细胞电生理研究，降压药及抗休克药的研究等。犬还可以通过训练，用于慢性实验研究，如条件反射、高血压的实验治疗、胃肠蠕动和分泌实验、慢性毒性实验。,非人灵长类动物，如猴(Monkey),主要用于药理学和毒理学、生殖生理、口腔医学）营养、代谢、行为学和高级神经活动研究及老年病、器官移植、眼科、内分泌病和畸胎学、肿瘤学。也用于传染病研究，猴可感染人类特有的传染病。如制造和鉴定脊髓灰质炎疫苗恒河猴是唯一的实验动物。,猫（Cat）,猫的神经系统和循环系统较发达，与人很相似。常用于神经、循环和呼吸方面的实验。,猪(Pig),常应用于皮肤烧伤、肿瘤学、免疫学、心血管及糖尿病、遗传性和营养性疾病、移植、外科手术等方面的研究,第二节 实验动物的分类,近交系 近交系一般是指采用20代以上全同胞兄弟妹妹或亲子（子女与年青的父母）进行交配，而培养出来的遗传基因纯化的品系。（F98.6% ）,杂交一代 由两个近交系杂交产生的子一代称为杂交一代。它既有近交系动物的特点，又获得了杂交优势。,封闭群 在同一血缘品系内，不以近交方式，而进行随机交配繁衍，经五年以上育成的相对维持同一血缘关系的种群。,1.按遗传学特征分类,突变品系 在育种过程中，由于单个基因的突变，或将某个基因导入，或通过多次回交“留种”，而建立一个同类突变品系，此类个体中有具同样遗传缺陷或病态。,非纯系 即一般任意交配繁殖的杂种动物。杂种动物具有旺盛的生命力，适应性强，繁殖率高，生长快，易于饲养管理。个体差异大，反应性不规则，实验结果的重复性差。但其中包含有最敏感的与最不敏感的两种极端的个体。,（二）实验动物的分类,普通动物（Conventional animals ,CV） 又称一级动物，是微生物控制要求中最低的一个级别的动物，要求不带有动物烈性传染病和人畜共患病原体 。,清洁动物（Clean animals ,CL） 又称二级动物，除不带有普通动物应排除的病原体外，还不应携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体。,2.按微生物学分类,无特殊病原体动物（Specific pathogens free animal，SPF动物） SPF动物又称三级动物，除不带有普通动物、清洁动物应排除的病原体外，还应排除有潜在感染或条件性致病的病原体，以及对实验干扰大的病原。,无菌动物（Germfree animals，GF）和悉生动物（Gnotobiotic animals，GN） 四级动物。无菌动物是指采用当前的技术手段无法在动物体表、体内检出一切其他生物体。,第三节 实验动物的选择,由于动物对外界刺激的反应存在个体差异，在选择实验动物时，还应注意动物的年龄、体重、性别、生理状态、健康状况及其品系、等级等因素对实验的影响。,例如，过敏反应或变态反应的研究宜选用豚鼠，因为豚鼠易于致敏。因家兔体温变化灵敏，故常用于发热、热原检定、解热药和过热的实验。狗、大鼠、 家兔常用于高血压的研究。,实验动物的种属选择 应注意影响动物实验效果的各种因素。尽可能选择其结构、功能和代谢特点接近于人类的动物，不同种属的动物对于同一刺激的反应也不同。,实验动物品系的选择 同一种属动物的不同品系，对同一刺激的反应也有很大差异。,例如：DBA2小鼠100的可发生听源性癫痫发作；而C57BL小鼠根本不出现这种反应,选用的动物应能较好地反映试验的目的，并符合节约的原则。例如：半数致死量和半数有效量：小白鼠；抗过敏实验：豚鼠在体心脏实验：蛙、大白鼠、豚鼠、猫、犬；离体心脏实验：蛙、大白鼠、豚鼠、家兔；离体血管实验：蛙的后肢血管、大白鼠和家兔的主动脉等。,第四节 实验动物的性别鉴别、编号、捉拿与固定,1. 实验动物的性别鉴别 在常用的动物中，较大的动物(如家兔、猫、犬等)可以从生殖器分辨其性别，而较小的动物(如小白鼠、大白鼠、豚鼠等)的性别鉴别，通常以肛门与生殖孔之间的距离来判断，距离近者为雌性，距离远者为雄性。,蛙和蟾蜍 毁脑和毁脊髓：左手食指和中指夹持蛙或蟾蜍的头部，无名指和小指握持双下肢，右手持刺针进行操作。淋巴囊注射：左手握持蛙或蟾蜍，食指和中指夹住左前肢，拇指压住右前肢；右手将双下肢拉直，左手无名指及小指将其压住而固定。,2、动物的捉拿、固定,蟾蜍,A,B,图3-2-1 青蛙(或蟾蜍)捉拿法 图3-2-2 青蛙(或蟾蜍)固定法,小白鼠 可采取双手法和单手法两种形式。 右手提起鼠尾，放在鼠笼盖或其他粗糙面上，向后方轻拉，小白鼠则将前肢固定于粗糙面上。此时迅速用左手拇指和食指捏 住小白鼠颈背部皮肤 (见图)，并以小指与手 掌尺侧夹持其尾根部， 固定于手中。,小鼠,图3-2-2小白鼠的捉拿法,大白鼠容易激怒咬人，捉持时左手应戴防护手套或用厚布盖住大鼠，先用右手抓住鼠尾，再用左手拇指和食指握住头部，其余手指与手掌握住背部和腹部(见图)。 不要用力过大，切勿捏 其颈部，以免窒息致死。,豚鼠 性情温顺不咬人，可用左手直接从背侧握持前部躯干，体重小者用一只手捉持，体重大者宜用双手，右手托住臀部(见图)。,家兔,猫猫较为温顺，可用一只手捉住猫的颈部皮肤，另一只手托起四肢部抱起(见图)。对凶暴猫，将手慢慢伸入笼内，轻抚猫的背、头、颈部。一只手抓住猫的颈部，取出笼外，另一只手捉住从背到腰部的皮肤。当猫不许手接触它的皮肤时，可用皮手套或用网捉拿。,犬用一捕犬叉夹住犬颈，另一人用一粗棉带绑住嘴巴，使其不能咬人。 绑嘴的方法（打3结）：将扁带绕上下颌一周，在上颌上打一结，然后转向下颌，再作一结，最后将带牵引至头后颈背上打第三结，在此结上须再打一活结以固定之。,染色法挂牌法,3、动物的编号,第五节 实验动物的给药方法,经消化道给药法注射给药法涂布给药法,1、经消化道给药法自动摄取法喂药法灌胃给药法经直肠给药,经口给药法 (1) 小鼠、大鼠、豚鼠、兔 灌胃法（i.g.） (2) 口服法（p.o.）,图3-2-9 小鼠灌胃法,小鼠灌胃：左手固定小鼠，右手持灌胃器，灌胃针头自口角进入口腔，紧贴上腭插入食道(见图)，如遇阻力，将灌胃针头抽回重插，以防损伤。常用灌胃量为0.10.2 ml/10g。,家兔灌胃： 一人将兔身固定于腋下，一手固定兔头，另一手将开口器放入兔口。另一人将导尿管从开口器孔插入口内，再慢慢插入食道和胃(见图)。为慎重起见，可将胃管外端放入水中，如无气泡，则可证实导尿管在胃内。灌胃量一般为10 ml/kg。如用兔固定盒，可由一人操作。,2、注射给药法 (1) 皮下注射 (s.c., H.) (2) 腹腔注射 (i.p.) (3) 肌肉注射 (i.m.) (4) 静脉注射 (i.v.) (5) 淋巴囊注射,腹腔注射 (i.p.),家兔静脉注射：一人固定兔身和兔头，另一人在使兔耳边缘血管(耳缘静脉)扩张后，从静脉末端刺入血管，左手拇指和食指固定针头和兔耳，右手注药(见图)。注药量一般为2 ml/kg，等渗液可达10 ml/kg。,静脉注射 (i.v.),wrong,小鼠尾静脉注射,蛙或蟾蜍淋巴囊注射给药 蛙皮下有数个淋巴囊(见图)，注药易吸收，常用腹淋巴囊。注药时，将蛙四肢固定，使腹部向上，注射针头从蛙大腿上部刺入，经大腿肌层入腹 壁肌层，再浅出至腹 壁皮下，即是腹淋巴 囊。此法可避免药液 外漏。注药量一般为 0.251.0 ml/只。,3、涂布给药法药物经皮肤吸收、局部作用或致敏作用时间根据药物性质和要求定,常用麻醉药氨基甲酸乙酯（乌拉坦）氯醛糖巴比妥类乙醚局部麻醉药,第六节、实验动物的麻醉,氯醛糖：适用于研究要求保留生理反射（如心血管反射）或研究神经系统反应的实验。乌拉坦：可导致较持久的浅麻醉，对呼吸无明显影响。,常用麻醉方法全身麻醉吸入麻醉注射麻醉局部麻醉,麻醉操作要求麻醉的基本原则注意不同个体的耐受性及时判断麻醉的深浅静脉麻醉坚持先快后慢原则补充麻醉麻醉注意事项,第七节、实验动物的采血、处死,一、采血1.尾巴尖采血：常用于大小鼠，小量采血。可以多次采血。2.眼眶静脉丛采血：常用于大小鼠、沙鼠的常规血液检查。微量采血。3.摘眼球采血:血量较多，常用于大小鼠、沙鼠4.腹主动脉采血：常用于大小鼠、沙鼠，动物要麻醉后进行，用针管在腹主动脉分叉处，与血管平行刺入，此法采血量大。5.心脏采血：6.兔耳缘静脉或耳中动脉、颈动脉采血7.犬 在前肢静脉、后肢小隐静脉采血8.猴 可在指尖、足跟、后肢皮下静脉、颈静脉采血9.猪 小型猪为耳大静脉、后肢静脉,实验动物的处死方法,蟾蜍：剪去头部大白鼠、小白鼠：脊椎脱臼法、断头法、打击法 豚鼠、兔等：空气栓塞法、急性放血法、药物法,第八节、实验动物手术,术前准备理论准备：了解结构、方法、应急措施等材料准备：动物准备、器械准备 药品准备、其他准备 仪器准备,手术麻醉动物固定动物备皮皮肤切开组织分离,结扎止血手术部位保护消毒缝合抗菌,实验药品给药剂量的确定,给药剂量可以按下列方法来确定：1. 根据有关文献、实验教材、实验参考书提供的药物剂量。由于药物批号不同、动物、环境条件的差异，必要时通过预备实验调整用药剂量。2. 根据临床常用有效剂量换算成实验动物剂量。,3.对于新药剂量的确定，先用小鼠粗略地探索中毒剂量或致死剂量，然后用小于中毒量的剂量，或取致死量的若干分之一为应用剂量，一般为1/101/5。通过预试来确定。4.化学药品可参考化学结构相似的已知药物，特别是其结构和作用都相似的药物剂量。,确定剂量后，如第一次实验的作用不明显，动物也没有中毒的表现(如体重下降、精神不振、活动减少或其它症状)，可以加大剂量再次实验。如出现中毒现象，作用也明显，则应降低剂量再次实验。一般情况下，在适宜的剂量范围内，有条件时最好同时用几个剂量作实验，以便迅速获得有关药物作用的较完整的资料。,实验动物与人用药量的换算,一般可按下列比例换算：如人用药量为1， 小鼠：1220倍 ； 大鼠、豚鼠：612倍； 兔：36倍 、 犬：23倍。也可按以下方法进行人与不同种类动物之间药物剂量的换算。,1. 按体表面积直接计算法： (1) 人体体表面积计算法：中国人的体表面积（m2） = 0.0061身高(cm)+ 0.0128体重(kg)0.1529,(2) 动物的体表面积计算：有多种方法，在需要由体重推算体表面积时，一般认为Meeh-Rubner公式较为适用，即： 体表面积 = K(W2/3/10000)注：W为体重，以g计算；K为一常数。 各种动物的K值： 小鼠和大鼠：9.1 豚鼠9.8 家兔10.1 猫9.8 犬11.2 猴11.8 人 10.6 (上列 K值各家报道略有出入),例：某利尿药大白鼠灌胃给药时的剂量为250 mg/kg，试粗略估计犬灌胃给药时可以试用的剂量。解：实验用大白鼠的体重一般在200 g左右，其体表面积(A)为：A = 9.1(2002/3/10000) = 0.031m2250 mg/kg的剂量如改以 mg/m2表示，即为：(2500.2)/0.031 = 1608 mg/m2实验用犬的体重一般在10 kg左右，其体表面积(A)为：A = 11.2100002/3/10000 = 0.5198m2于是犬的适当试用剂量为16080.5198/10 = 84 mg/kg。,2. 按mg/kg折算mg/m2转换因子计算： 即按甲动物剂量(mg/kg)甲动物转换因子/乙动物转换因子计算。mg/kg的相应转换因子为：小鼠：3；大鼠：6；豚鼠：8；家兔：12； 猫：14；狗：19；人：36。如上例：犬灌胃给药的剂量=250X6（大鼠转换因子）/19（狗转换因子）=79 mg/kg 。,3. 按每kg体重占有体表面积相对比值计算：各种动物的“每