DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法_第1页
DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法_第2页
DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法_第3页
DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法_第4页
DB34∕T 2716-2016 两系水稻不育基因鉴定功能标记法_第5页
已阅读5页,还剩9页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

ICS 65 020 01 B 04 DB34 安徽省地方标准 DB 34 T 2716 2016 两系水稻不育基因鉴定 功能标记法 Identification of two line rice male sterile genes functional marker method 文稿版次选择 2016 09 27 发布 2016 10 27 实施 安徽省质量技术监督局 发 布 DB34 T 2716 2016 I 前 言 本标准按照 GB T 1 1 2009 给出的规则起草 本标准归口单位 安徽省农业标准化技术委员会 本标准起草单位 安徽省农业科学院水稻研究所 本标准主要起草人 宋丰顺 杨剑波 倪大虎 倪金龙 陆徐忠 李莉 汪秀峰 魏鹏程 杨亚春 马卉 李浩 秦瑞英 许学 李娟 DB34 T 2716 2016 1 两系水稻不育基因鉴定 功能标记法 1 范围 本标准规定了两系水稻不育基因功能标记检测的术语和定义 原理 主要仪器 试剂与溶液 操作 步骤 带型记录和结果判定 本标准适用于两系水稻不育基因鉴定 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件 仅所注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件 其最新版本 包括所有的修改单 适用于本文件 GB T 3543 2 农作物种子检验规程 扦样 GB T 3543 4 农作物种子检验规程 发芽试验 GB 4404 1 粮食作物种子 第1部分 禾谷类 GB T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3 1 功能标记 Functional Marker 根据基因内部引起表型性状变异的功能突变位点开发出来的一种分子标记 3 2 两系水稻 Two Line Rice 本标准将两系不育系和两系杂交水稻统称为两系水稻 两系不育系是指利用水稻的光温敏核不育特 性选育的水稻雄性不育系 其在短日低温条件下表现为雄性可育 可以繁殖种子 在长日高温条件下表 现为雄性不育 可用于杂交稻制种 两系杂交水稻是指利用两系不育系与恢复系杂交产生的 F1 代 3 3 标准样品 Standard Sample 标准样品是指经权威机构认定认证的代表已知品种特征特性的样品 本标准中包括阴性标准样品和阳性标准样品 阴性标准样品是指不携带 pms3 基因和tms5 基因的水稻种子 幼叶或 DNA DB34 T 2716 2016 2 阳性标准样品是指携带 pms3 基因或 tms5 基因的水稻种子 幼叶或 DNA 包括 pms3 型不育系标 准样品 pms3 型杂交水稻标准样品 tms5 型不育系标准样品和tms5 型杂交水稻标准样品 3 4 送验样品 Submit Sample 送到种子检验机构检验的样品 4 原理 4 1 生产上大规模应用的两系水稻按其不育基因种类可分为 pms3 型和tms5 型两类 4 2 根据不育基因 pms3 和tms5 的功能突变位点序列与可育基因 PMS3 和 TMS5 不同 设计引物 扩增功能突变位点 用限制性内切酶特异切割不育基因的扩增产物 而不酶切可育基因的扩增产物 形 成片段长度多态 从而将不育基因 可育基因以及两者的杂合体区分开 5 主要仪器 5 1 PCR 扩增仪 5 2 离心机 最大离心力 12 000 g 5 3 电泳检测系统 水平电泳系统 5 4 微量移液器 规格分别为 2 L 20 L 100 L 200 L 1000 L 连续可调 5 5 低温冰箱 最低温度 20 5 6 凝胶成像系统 5 7 高压灭菌锅 5 8 电子天平 精确度 0 001 g 5 9 恒温水浴锅 温控精确度 1 5 10 磁力搅拌器 5 11 微波炉 5 12 紫外分光光度计 5 13 酸度计 精度 0 01pH 6 试剂和溶液 6 1 试剂要求 仅使用分析纯试剂和符合 GB T 6682 规定的一级水 6 2 试剂 6 2 1 十六烷基三乙基溴化铵 CTAB 6 2 2 三羟甲基氨基甲烷碱 Tris Base 6 2 3 乙二胺四乙酸二钠 EDTA Na2 2H2O 6 2 4 浓盐酸 6 2 5 氢氧化钠 6 2 6 氯化钠 DB34 T 2716 2016 3 6 2 7 三氯甲烷 6 2 8 异戊醇 6 2 9 异丙醇 6 2 10 无水乙醇 6 2 11 液氮 6 2 12 DNA 聚合酶及其 GC BufferI 和 GC BufferII 6 2 13 四种脱氧核苷酸 dATP dGTP dCTP dTTP 缩略为 dNTPs 6 2 14 限制性内切酶 Rsa I 6 2 15 两系水稻不育基因功能标记引物 引物序列见附录 A 6 3 溶液 见附录B 7 操作程序 7 1 样品制备 7 1 1 送验样品可为水稻的种子 叶片或其他等效物 送验样品为种子时 其分样和保存应符合 GB T 3543 2 的规定 种子发芽按 GB T 3543 4 规定执行 7 1 2 用于两系水稻类型检测的送验样品 其纯度应符合 GB 4404 1 的规定 随机抽取至少 5 粒种子 或 5 个叶片 分别提取基因组 DNA 委托方指定的单株叶片 可直接提取 DNA 7 1 3 用于两系杂交水稻不育株率鉴定的送验样品 应随机抽取至少 100 粒种子 或 100 个单株 分 别提取基因组 DNA 7 1 4 以相应标准样品作为对照 7 2 DNA 提取 将水稻幼苗或叶片约 5 cm 置于 2 0 mL 离心管中 加液氮用玻棒充分研磨至粉末状 向离心管 中加入 700 L 65 预热的 DNA 提取液 65 孵育 1 h 每隔 15 min 颠倒混匀一次 加入等体积氯 仿 异戊醇混合液 轻缓混匀 室温静置 15 min 12 000 g 离心 10 min 吸取上清液至另一支 1 5 mL 离心管中 再加入等体积异丙醇混匀 置于 20 30 min 4 12 000 g 离心 10 min 弃上清 加 入 1 0 mL 70 乙醇洗涤沉淀 12 000 g 离心 10 min 后弃去乙醇 室温干燥后加入 100 L 灭菌水 充分溶解 检测浓度 用灭菌水将提取的 DNA 终浓度稀释至 50 ng L 20 保存留用 注 以上为推荐的 DNA 提取方法 其他能达到 PCR 扩增质量要求的 DNA 提取方法都适用于本标准 7 3 功能标记检测 7 3 1 PCR 扩增 用附录A 中引物对样品 DNA 进行扩增 PCR 扩增反应体系见附录C 表C 1 和表C 2 反应程序为 95 5 min 94 30 s 55 30 s 72 30s 循环 35 次 72 5 min 4 保 存 7 3 2 酶切 PCR 反应完成后 在反应液中加入 1 2U Rsa I 酶 推荐反应程序为 37 孵育 4 h 16 h DB34 T 2716 2016 4 7 3 3 电泳检测 PCR 酶切产物采用琼脂糖凝胶电泳检测 参见附录D 8 带型记录 送验样品在检测位点的基因型用扩增片段酶切后长度的变化表示 将送验样品的电泳图谱与相应标 准样品进行比较 确定送验样品的各条带分子量 带型数据记录为 x y 其中 x y 表示条带有无和分子量大小 对于 pms3 M 标记 x 和 y 分别代表 454 bp 和 369 bp 位置 DNA 片段的有无 对于 tms5 M 标 记 x 和 y 分别代表 172 bp 和 146 bp 位置 DNA 片段的有无 有片段则记录为片段的大小 无片段 则记录为 0 示例1 pms3 M 标记检测不育系 培矮 64 s 454 bp 处未出现条带 369 bp 处出现条带 则该品种pms3 基因 带型记录为 0 369 示例2 tms5 M 标记检测品种 皖稻 153 在 172 bp 和 146 bp 处都有条带 则该品种tms5基因带型记录为 172 146 9 结果判定 9 1 两系水稻类型判定 根据附录A 表A 1 中的功能标记在送验样品中扩增产物的酶切电泳图谱和带型记录 判断不育基因 存在与否及其类型 表1 表1 根据带型判定两系水稻类型 带型记录 判定结果 pms3 M tms5 M 454 0 172 0 不含有 pms3 和 tms5 的水稻 0 369 172 0 pms3 纯合型水稻 454 369 172 0 pms3 型杂交水稻 454 0 172 146 tms5 型杂交水稻 454 369 172 146 pms3 和 tms5 型杂交水稻 454 0 0 146 tms5 纯合型水稻 0 369 0 146 pms3 和 tms5 纯合型水稻 9 2 两系杂交水稻不育株率判定 根据两系不育基因功能标记检测结果 两系杂交水稻具有父母本互补带型 454 369 或 和 172 146 而两系不育株仅具有母本带型 0 369 或 和 0 146 判定两系杂交水稻中混入的不育株 根据每个受检单株的带型记录 按公式 1 计算受验样品的不育株率 100 r D N N P 1 式中 DB34 T 2716 2016 5 P 两系杂交水稻的不育株率 NT 供检种子粒数 幼苗数 株数 ND 具有 0 369 pms3 M 或 0 146 tms5 M 带型的种子粒数 幼苗数 株数 DB34 T 2716 2016 6 A A 附 录 A 规范性附录 两系水稻不育基因功能标记及标准样品检测结果 A 1 功能标记 用于两系水稻鉴定的功能标记名称 基因 引物序列 扩增产物大小和限制性内切酶 见表A 1 表A 1 用于两系水稻鉴定的功能标记 功能标记名称 基因 正向引物序列 5 3 反向引物序列 5 3 扩增产物 大小 内切酶 pms3 M pms3 AGCACGTCCATATTGAATGCC CCGTTATAGATAGACCCGAGA 454bp Rsa I tms5 M tms5 CTCGACGGTGAGGGGCGGCGCCTTG CCGGCCCATCGTGCTTCGTGCCAAA 172bp Rsa I A 2 标准样品的检测结果 用 pms3 M 标记检测 pms3 基因 扩增产物被 Rsa I 酶切后 阴性标准样品 不携带 pms3 基因 只有一条 454 bp 的片段 pms3 型不育系标准样品有 369 bp 和 85 bp 的 2 个片段 pms3 型杂交水 稻标准样品形成 454 bp 369 bp 和 85 bp 的 3 个片段 用 tms5 M 标记检测 tms5 基因 扩增产物被 Rsa I 酶切后 阴性标准样品 不携带 tms5 基因 只有一条 172 bp 的片段 tms5 型不育系标准样品会出现一条 146 bp 的片段 tms5 型杂交水稻标准 样品会出现 172 bp 和 146 bp 的 2 个片段 DB34 T 2716 2016 7 B B 附 录 B 资料性附录 溶液 B 1 1 mol L Tris HCl 溶液 60 55 g Tris 碱溶于适量水中 加 HCl 调 pH 至 8 0 定容至 500 mL 在 103 4 kPa 121 条件下灭菌 20 min B 2 0 5 mol L EDTA 溶液 187 6 g EDTA Na2 2H2O 溶于 800 mL 水中 用 NaOH 调 pH 值至 8 0 定容至 1000 mL 在 103 4 kPa 121 条件下灭菌 20 min B 3 DNA 提取液 81 7 g NaCl 和 20 g CTAB 充分溶于适量水中 然后加入 1 mol L Tris HCl 100 mL 0 5 mol L EDTA 40 mL 定容至 1000 mL 在 103 4 kPa 121 条件下灭菌 20 min 4 贮存 B 4 氯仿 异戊醇混合液 体积比为 24 1 B 5 70 乙醇溶液 B 6 加样缓冲液 2 5 mg mL 溴酚兰 40 m V 蔗糖 B 7 50 Tris 乙酸电泳缓冲液 50 TAE 2 mol L Tris 乙酸 50 mmol L EDTA pH 8 0 在103 4 kPa 121 条件下灭菌 20 min 4 贮存 B 8 溴化乙锭 EB 贮液 10 mg mL 溴化乙锭 EB 注 溴化乙锭为强诱变剂 不得直接接触皮肤 DB34 T 2716 2016 8 C C 附 录 C 资料性附录 PCR 扩增体系 C 1 pms3 M 标记 PCR 扩增体系 各组分配制见表C 1 表C 1 pms3 M 标记 PCR 反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐反应体积 25 L 2 GC buffer I Mg 2 plus 2 1 12 5 dNTPs 每种 2 5 mmol L 0 16 mmol L 1 6 rTaq 酶 5 0 U L 0 04 U L 0 2 上游引物 10 mol L 0 4 mol L 1 0 下游引物 10 mol L 0 4 mol L 1 0 模板 DNA 50ng L 2ng L 1 0 ddH2O 7 7 C 2 tms5 M 标记 PCR 扩增体系 各组分配制见表C 2 表C 2 与表C 1 的区别为 2 GC buffer I 被替换为 2 GC buffer II 表C 2 tms5 M 标记 PCR 反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐反应体积 25 L 2 GC buffer II Mg 2 plus 2 1 12 5 dNTPs 每种 2 5 mmol L 0 16 mmol L 1 6 rTaq 酶 5 0 U L 0 04 U L 0 2 上游引物 10 mol L 0 4 mol L 1 0 下游引物 10 mol L 0 4 mol L 1 0 模板 DNA 50ng L 2ng L 1 0 ddH2O 7 7 DB34 T 2716 2016 9 D D 附 录 D 资料性附录 琼脂糖凝胶电泳 D 1 凝胶制备 D 1 1 pms3 M 标记凝胶制备 按 2 0 m v 的琼脂糖浓度配制凝胶 将 1 TAE 电泳缓冲液和琼脂糖混合煮沸熔化 冷却至 55 60 加入 0 01 凝胶体积的溴化乙锭 混匀 倒入已封好的胶槽中 插上样品梳 待凝胶凝固后 拔出梳子 放入加有 1 TAE 电泳缓冲液的电泳槽中 缓冲液高出凝胶表面约 1 mm D 1 2 tms5 M 标记凝胶制备 按 4 0 m v 的琼脂糖浓度配制凝胶 其他与 D 1 1 同 D 2 加样 取 15 L PCR 酶切产物 加入 3 L 加样缓冲液A 混匀 用微量移液器将其加入样品孔中 D 3 电泳 接通电极 使 DNA 向阳极移动 在 5V cm 电压降下进行电泳 当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足 够距离时 关闭电源 pms3 M 标记电泳约 40 min tms5 M 标记电泳约 1 h 1 5 h 可以分出多态 D 4 照相 在凝胶成像系统上观察照相 DB34 T 2716 2016 10 参 考 文 献 1 Ding J Lua Q Ouyang Y Mao H Zhang P Yao J Xua C Lia X Xiao J Zhang Q

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论