ELISA的概念、原理、操作步骤

ELISA 的概念 原理 操作步骤 ELISA 是酶联接免疫吸附剂测定 Enzyme Linked Immunosorbnent Assay 的简称 它是继 免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术 此项技术自 70 年代初问世以来 发展十分迅速 目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域 一 原理 ELISA 是以免疫学反应为基础 将抗原 抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术 由于抗原 抗体的反应在一种固相载体 聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行 每加入一种试剂孵育后 可通过洗涤除去多余的游离反 应物 从而保证试验结果的特异性与稳定性 在实际应用中 通过不同的设计 具体的方 法步骤可有多种 即 用于检测抗体的间接法 图 a 用于检测抗原的双抗体夹心法 图 b 以 及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等 比较常用的是 ELISA 双抗体夹心法及 ELISA 间接法 二 操作步骤 方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法 1 包被 用 0 05M PH9 牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1 10 g ml 在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0 1ml 4 过夜 次日 弃去孔内溶液 用洗涤缓冲液洗 3 次 每次 3 分钟 简称洗涤 下同 2 加样 加一定稀释的待检样品 0 1ml 于上述已包被之反应孔中 置 37 孵育 1 小 时 然后洗涤 同时做空白孔 阴性对照孔及阳性对照孔 3 加酶标抗体 于各反应孔中 加入新鲜稀释的酶标抗体 经滴定后的稀释度 0 1ml 37 孵育 0 5 1 小时 洗涤 4 加底物液显色 于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0 1ml 37 10 30 分钟 5 终止反应 于各反应孔中加入 2M 硫酸 0 05ml 6 结果判定 可于白色背景上 直接用肉眼观察结果 反应孔内颜色越深 阳性程 度越强 阴性反应为无色或极浅 依据所呈颜色的深浅 以 号表示 也可测 O D 值 在 ELISA 检测仪上 于 450nm 若以 ABTS 显色 则 410nm 处 以空白对照孔 调零后测各孔 O D 值 若大于规定的阴性对照 OD 值的 2 1 倍 即为阳性 方法二 用于检测未知抗体的间接法 用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1 10 g ml 每孔加 0 1ml 4 过夜 次日洗涤 3 次 加一定稀释的待检样品 未知抗体 0 1ml 于上述已包被之反应孔中 置 37 孵育 1 小时 洗涤 同时做空白 阴性及阳性孔对照 于反应孔中 加入新鲜稀释的酶标第二抗体 抗抗 体 0 1ml 37 孵育 30 60 分钟 洗涤 最后一遍用 DDW 洗涤 其余步骤同 双抗体夹心 法 的 4 5 6 三 试剂器材 1 试剂 1 包被缓冲液 PH9 6 0 05M 碳酸盐缓冲液 NaCO3 1 59 克 NaHCO3 2 93 克 加蒸馏水至 1000ml 2 洗涤缓冲液 PH7 4 PBS 0 15M KH2PO4 0 2 克 Na2HPO4 12H2O 2 9 克 NaCl 8 0 克 KCl 0 2 克 Tween 20 0 05 0 5ml 加蒸馏水至 1000ml 3 稀释液 牛血清白蛋白 BSA 0 1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清 兔血 清等 血清与洗涤液配成 5 10 使用 4 终止液 2M H2SO4 蒸馏水 178 3ml 逐滴加入浓硫酸 98 21 7ml 5 底物缓冲液 PH5 0 磷酸棗柠檬酸 0 2M Na2HPO4 28 4 克 L 25 7ml 0 1M 柠檬 酸 19 2 克 L 24 3ml 加蒸馏水 50ml 6 TMB 四甲基联苯胺 使用液 TMB 10mg 5ml 无水乙醇 0 5ml 底物缓冲液 PH5 5 10ml0 75 H2O2 32 l 7 ABTS 使用液 ABTS 0 5mg 底物缓冲液 PH5 5 1ml 3 H2O2 2 l 8 抗原 抗体和酶标记抗体 9 正常人血清和阳性对照血清 2 器材 1 聚苯乙烯塑料板 简称酶标板 40 孔或 96 孔 ELISA 检测仪 50 l 及 100 l 加样 器 塑料滴头 小毛巾 洗涤瓶 2 小烧杯 玻璃棒 试管 吸管和量筒等 3 4 冰箱 37 孵育箱 四 注意事项 1 正式试验时 应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件 待检样品应作一式二 份 以保证实验结果的准确性 有时本底较高 说明有非特异性反应 可采用羊血清 兔 血清或 BSA 等封闭 2 在 ELISA 中 进行各项实验条件的选择是很重要的 其中包括 1 固相载体的选择 许多物质可作为固相载体 如聚氯乙烯 聚苯乙烯 聚丙酰胺 和纤维素等 其形式可以是凹孔平板 试管 珠粒等 目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板 不管何种载体 在使用前均可进行筛选 用等量抗原包被 在同一实验条件下进行反应 观察其显色反应是否均一性 据此判明其吸附性能是否良好 2 包被抗体 或抗原 的选择 将抗体 或抗原 吸附在固相载体表面时 要求纯度要 好 吸附时一般要求 PH 在 9 0 9 6 之间 吸附温度 时间及其蛋白量也有一定影响 一般多 采用 4 18 24 小时 蛋白质包被的最适浓度需进行滴定 即用不同的蛋白质浓度 0 1 1 0 和 10 g ml 等 进行包被后 在其它试验条件相同时 观察阳性标本的 OD 值 选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度 对于多数蛋白质来说通常为 1 10 g ml 3 酶标记抗体工作浓度的选择 首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定 见酶标 记抗体部份 然后再固定其它条件或采取 方阵法 包被物 待检样品的参考品及酶标 记抗体分别为不同的稀释度 在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度 4 酶的底物及供氢体的选择 对供氢体的选择要求是价廉 安全 有明显地显色反 应 而本身无色 有些供氢体 如 OPD 等 有潜在的致癌作用 应注意防护 有条件者应使 用不致癌 灵敏度高的供氢体 如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体 底物作用一 段时间后 应加入强酸或强碱以终止反应 通常底物作用时间 以 10 30 分钟为宜 底物 使用液必须新鲜配制 尤其是 H2O2 在临用前加入 一 实验目的 1 深入了解 ELISA 法测定抗体效价的原理 2 掌握 ELISA 法测定单克隆抗体效价的方法 二 实验原理 ELISA 是以免疫学反应为基础 将抗原 抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相 结合起来的一种敏感性很高的试验技术 免疫酶技术是将酶标记在抗体 抗原分子上 形成 酶标抗体 酶标抗原 称为酶结合物 该酶结合物的酶在免疫反应后 作用于底物使之呈色 根据颜色的有无和深浅 定位或定量抗原 抗体 ELISA 法是免疫酶技术的一种 其特点 是利用聚苯乙烯微量反应板 或球 吸附抗原 抗体 使之固相化 免疫反应和酶促反应都在 其中进行 在每次反应后都要反复洗涤 这既保证了反应的定量关系 也避免了末反应的 游离抗体 抗原的分离步骤 在 ELISA 法中 酶促反应只进行一次 而抗原 抗体的免疫 反应可进行一次或数次 即可用二抗 抗抗体 三抗再次进行免疫反应 目前常用的几种 ELISA 方法有 测定抗体的间接法 测定抗原的双抗体夹心法和测定抗 原的竞争法等 本实验采用间接法测定单克隆抗体效价 其主要过程为 首先将已知定量 抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内 加待测抗体 保温后洗涤以除去未结合的杂蛋 白质 加酶标抗抗体 保温后洗涤 加底物保温 30 分钟后 加酸或碱终止酶促反应 用目 测或光电比色测定抗体含量 三 仪器 原料和试剂 仪器 聚苯乙烯 96 孔酶标板 微量移液管 酶联免疫阅读仪 水浴锅 原料 单克隆抗体 试剂 1 抗原及酶标记抗体 抗原 兔抗人 IgG Rabbit Aanti human IgG Code No A0423 酶标抗抗体 兔抗鼠 IgG HRP Rabbit Anti mouse IgG HRP Code No P0260 均为 DAKO 公司产品 使用时按照说明书要求稀释 4 洗涤液 含 0 05 Tween 20 的 PBS 1LPBS 中加入 Tween 20 500 L 5 封闭液 含 1 牛血清白蛋白 0 1 Tween 20 的 PBS 10mLPBS 中加入 100mgBSA 10 LTween 20 6 底物溶液 磷酸钠盐缓冲液 0 1mol LpH6 0 称 Na2HPO4 12H2O2 2g NaH2PO4 2H2O 6 84g 用蒸馏水溶解 定容至 500mL TMB 贮液 称 60mgTMB 溶于 10mL 二甲基亚砜中 4 避光保存 底物应用液 现用现配 磷酸钠缓冲液 10mL TNB 贮液 10 L 30 H2O2 15 L 混 匀 7 终止液 2mol LH2SO4 四 操作步骤 抗原包被 兔抗人 IgG 作为抗原 用包被液 l 8000 稀释 100 L 孔加入聚苯乙烯 96 孔反应板 中 4 放置过夜 洗涤 次日倾去凹孔内的液体 洗涤液洗 3 次 封闭 加 l00 L 孔封闭液 室温放置 0 5h 洗涤 用洗涤液洗 3 次 加待测样品 一抗 将含单克降抗体的细胞培养上清在另 块板上用 PBS 连续稀释 按照 1 2 或 1 10 100 L 孔加到已包被的板上 每个样品平行做两份 PBS 或空白培养基 作为阴性对照 已知样品作为阳性对照 加盖 37 恒温箱温