基因工程和蛋白质工程简介ppt课件.ppt

第一节DNA重组和基因工程 基因工程亦称遗传工程 即利用DNA重组技术的方法 把DNA作为组件 在细胞外将一种外源DNA 目的基因 和载体DNA重新组合连接 重组 最后将重组体转入宿主细胞 使外源基因DNA在宿主细胞中 随细胞的繁殖而增殖 cloning 克隆 或最后得到表达 最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状 一 DNA重组的技术路线二 基因工程的应用与前景三 DNA体外重组常用的酶 返回 DNA重组的技术路线 1 目的基因的制备2 载体的构建3 目的基因与载体的重组4 重组体导入宿主细胞进行扩增5 克隆基因的鉴定 Ti质粒结构 植物冠瘿瘤 pBR322质粒的结构 以 噬菌体为载体进行DNA克隆 DNA 用限制性内切酶除去中间一段 与外源DNA连接 重组载体的体外包装 带有外源DNA的 噬菌体 太小不能被包装 噬菌体感染大肠杆菌的途径 DNA重组体的筛选 载体特征的直接筛选 菌落的原位杂交 免疫学方法 pBR322质粒结构 如果外源DNA插入 氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源DNA插入 四环素抗性基因失活 原位杂交法筛选DNA重组体图解 复印至硝酸纤维素膜上 用NaOH菌体裂解DNA变性 杂交 放射自显影 32P cDNA 与放射性cDNA杂交的菌落的斑点 细菌菌落 单链DNA结合到膜上 Southern印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 Southern和Western印迹法 DNAfrangment Electrophoresis TransferofDNAbyblotting 32P labledDNAprobe Autoradiography Agarrosegel Autoradiogram Nitrocellulosesheet Autoradiogram Polymersheet SDS Polyacrylamidegel Transferprotein Addradiolabledspesficantibody Washtoremoveunboudantibody Proteinbanddetectedbyspecificantibody Autoradiography DNA重组技术的应用 1 开辟生物学研究的新纪元 反向生物学 invesebiology 的诞生 2 促进生物技术产业的兴起 基因药物 基因诊断和治疗 转基因动植物 胰岛素原的人工合成 胰脏 A n胰岛素原mRNA cDNA 重组质粒 转化细菌 mRNA 反转录酶 胰岛素原基因 与质粒连接 感染E coli 胰岛素原 Ti质粒为载体的植物基因工程 I二元载体系统 II共整合载体 IIIT DNA的转移与整合 Ti辅助质粒 Ti辅助DNA给体质粒 Ti辅助DNA给体质粒 pBR型质粒 给体质粒 宿主特异性 外源基因 宿主特异性 整合 带有外源基因的Ti质粒 植物DNA Ti质粒转移并插入植物DNA 第二节蛋白质工程简介 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 在广泛利用自然界存在的各种蛋白质的过程中发现 这些蛋白质只是适应生物自身的需要 而对于它们的产业化开发往往并不合意 需要加以改造 1983年美国基因公司的Ulmer首先提出蛋白质工程这个名词 它是指按照特定的需要 对蛋白质进行分子设计和改造的工程 自此之后 蛋白质工程迅速发展 生物工程的重要组成部分 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础 通过蛋白质一级结构 晶体结构和溶液构象的研究 积累成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料 然后按照蛋白质形成的规律 经周密的分子设计 改造蛋白质或构建新的蛋白质 研究得多 取得成果最显著的是生物技术药 激素 细胞因子 酶 酶的激活剂 受体和配体 细胞毒素和杀菌肽以及抗体等 和工业用酶的蛋白质工程 生物酶工程示意图 酶的蛋白质结构功能 新酶分子蓝图 选择性修饰方案 突变酶 新酶 克隆酶 产品 效用 发展 酶基因 遗传设计 遗传修饰 DNA重组技术 DNA重组技术 蛋白质技术和核酸技术的相互增强 插入表达载体 转化寄主细胞 推导出AA顺序 制备合成肽 制备对所编码蛋白专一的抗体 基因或cDNA 蛋白质 测定出AA顺序 合成cDNA探针 制备专一的抗体 沉淀核糖体分离mRNA 用Southern印迹法筛选DNA文库 基因或cDNA 第三节核酸研究技术简介 一 DNA序列测定二 基因文库与cDNA文库三 聚合酶链式反应 polymerasechainreaction PCR DNA测序的基本战略 设法产生带标记的不同长度的成套DNA片段 各带有标记的片段起点相同 终点不同 使待测的DNA链中的相应每个核苷酸处都有断裂或终止 通过PAGE电泳 能够将相差一个核苷酸的DNA片段分开 放射自显影后 根据长短排列 根据特定末端碱基的DNA片段就可读出待测DNA的碱基序列 酶法 化学法 测序技术进展 酶法序列分析的原理 酶反应 电泳方向 5 3 引物 dATPdCTPdGTPdTTP ddATP dATPdCTPdGTPdTTP ddTTP dATPdCTPdGTPdTTP ddGTP dATPdCTPdGTPdTTP ddCTP GGCCA GGCCATCGTTGA GGC GGCC GGCCATC GGCCATCGTTG GGCCATCG GGCCAT GGCCATCGT GGCCATCGTT ACGT GGCCATCGTTGA GGCCATCGT GGCCATCGTTG GGCCATCGTT GGCCATCG GGCCATC GGCCA GGCCAT GGCC GGC DNA的Sanger测序法 酶法 dNTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA CTGACTTCGACAAAGAA 5 3 DNA的测序仪示意图 computeranalysis 凝胶中DNA移动方向 样品槽 激光器 输入光学系统 成象透镜 聚焦透镜 高灵敏度相机 旋光镜 棱镜组件 DNA的化学测序示意图 反应试剂G反应 硫酸二甲酯G A反应 甲酸T C反应 肼C反应 NaCl 肼 测序技术进展同位素标记到荧光标记 平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记毛细管电泳 单色荧光标记平板电泳 同位素标记平板电泳 A C G T 测序图谱 TATTGCATTGTCTGCATTGTCT 引物标记法测序 DyePrimer 一个样本 4个反应 4个反应中引物序列相同 但分别标记有不同颜色的荧光 反应结束后 将4管反应液混合 经乙醇沉淀后上样 终止法测序 DyeTerminator 一个样本 1个反应 反应中包含分别带4色荧光标记的ddNTP 终止子 测序反应结束后 采用乙醇沉淀法进行纯化 除去过量的ddNTP后上样 三 基因文库与cDNA文库 1 基因文库 genomiclibrary cDNA文库 complementalDNAlibrary 2 文库的构建 基因文库 基因文库是指整套由基因组DNA片段插入克隆载体获得的分子克隆之总和 应用DNA重组技术 可以将各种生物体全部基因组的遗传信息 贮存在可以长期保存的稳定重组体中 以备需要时应用 好象将文献资料贮存于图书馆一样 所以称其为genomiclibrary 基因文库中应包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以极高的概率存在于该文库中 其计算公式如下 N ln 1 p ln 1 f N 基因文库所包含克隆的数目 p 任意所需基因存在于基因文库中的概率 要求大于99 f 克隆的DNA片段大小 bp 占基因组大小 bp 的分数 cDNA文库 真核细胞基因是断裂的 在基因最后产物中表达的编码序列 外显子 被非编码序列 内含子 分隔开 需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起 真核生物基因不能在原核生物中表达 只有将加工成熟的mRNA反转录成cDNA complementalDNA 接上原核生物表达控制元件 才能在原核生物中表达 再有 真核生物的基因通常只有一小部分进行表达 由于mRNA的不稳定性 对基因表达和有关mRNA都通常通过对其cDNA来进行研究的 将细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和称为cDNA文库 RNA病毒的基因组是RNA 也必须将RNA先转录成cDNA 再建立文库 为使低丰度的mRNA的cDNA克隆存在的概率大于99 cDNA文库应含的克隆数的计算公式如下 N ln 1 p ln 1 1 n N cDNA文库所包含克隆的数目 p 低丰度cDNA存在于基因文库中的概率 要求其大于99 1 n 每一种低丰度的mRNA占总mRNA的分数 基因文库和cDNA文库的建立 组织 可克隆之DNA 载体 DNA cDNA mRNA 部分或完全酶解DNA DNA长度分级 甲基化 双链接头DNA DNA与载体连接 引入大肠杆菌 鉴定文库的滴度和特性 扩增后供长期储存 筛选出所需要的克隆 噬菌体为载体的基因文库的构建 四 聚合酶链式反应 PCR 1985年Mullis发明PCR polymerasechainreaction 快速扩增DNA的方法