2010级研究生双向与光合实验

1 2010 级研究生级研究生 植物科学实验技术植物科学实验技术 双向电泳技术 双向电泳技术 524 lab 一 实验目的 一 实验目的 了解蛋白质组学研究中的基本实验设计思路 掌握蛋白质组双向电泳实验流程及相关软件分析 二 材料与试剂二 材料与试剂 材料材料 叶片 墨兰 石斛 叶片 墨兰 石斛 花芽 春石斛 蝴蝶兰 花芽 春石斛 蝴蝶兰 蝴蝶兰花瓣 白色 红色 蝴蝶兰花瓣 白色 红色 蝴蝶兰花苞蝴蝶兰花苞 仪器仪器 聚焦仪 天平 电子秤 适用于 2ml 10ml 50ml 离心管的高速离心机 PH 计 磁力搅拌器 低温冰箱 真空泵 紫外分光光度计 水浴锅等 试剂试剂 三氯乙酸 TCA 丙酮 巯基乙醇 Tris base 牛血清蛋白 考马斯亮蓝 G 250 无水乙醇 尿素 Urea 硫脲 Thiourea CHAPS DTT 碘乙酰胺 IAA IPG buffer PH3 10 IPG 预制胶条 7cm PH3 10 丙烯酰胺 甲叉双丙烯酰胺 SDS 过硫酸铵 Ap 甘氨酸 Gly 硫酸铵 甲醇 溴酚 蓝 超纯水 液氮 正磷酸等 器皿器皿 研钵 10ml 50ml 100ml 500ml 容量瓶 10ml 500ml 烧杯 1 5ml 50ml 离心管 50ml 量筒 1ml 5ml 2 5ul 10ul 20ul 100ul 微量移液器 100ml 棕色瓶 冰盒 滤纸 玻璃棒 记号笔 布氏漏斗 试管等 三 实验流程三 实验流程 I 样品制备样品制备 A 蛋白质制备方法 蛋白质制备方法 全程低温 操作尽量快 准 双向电泳最重要 最基础步骤双向电泳最重要 最基础步骤 A 1 TCA 丙酮沉淀法丙酮沉淀法 墨兰 石斛叶片墨兰 石斛叶片 1 称取 0 3 克左右样品 在预冷的研钵中 液氮研磨成粉 2 粉末转移至 10ml 离心管中 加入 6 8ml 10 TCA 丙酮丙酮 20 沉淀过夜 至少 2 小时 震荡几次 3 取沉淀过夜的样品重量平衡 离心 13200rpm 4 30min 弃上清 4 向沉淀中加入 6 8ml 冷丙酮 混匀并进行重量平衡 20 沉淀 20min 离心 13200rpm 4 30min 弃上清 此过程重复三次 5 向沉淀中加 6 8ml 80 冷丙酮混匀并进行天平平衡 20 沉淀 20min 然后离心 13200rpm 4 30min 弃上清 此过程重复两次 6 转移沉淀到 1 5ml 离心管中 加 1ml 冷丙酮洗涤 沉淀两次 离心 0 5min 7 真空冰浴抽滤 干燥沉淀至干粉 80 低温保存 补充 醋酸铵补充 醋酸铵 甲醇沉淀法甲醇沉淀法 基本步骤同 TCA 丙酮沉淀法 只是第 2 步加入的是 0 1M 醋酸铵醋酸铵 甲醇甲醇 A 2 酚抽提法酚抽提法 石斛 蝴蝶兰花芽石斛 蝴蝶兰花芽 1 称取 0 3 克左右样品 在预冷的研钵中 液氮研磨成粉 2 粉末转移至 10ml 离心管中 加入酚抽提液与水饱和酚酚抽提液与水饱和酚混匀 离心 13200rpm 4 20min 3 吸取上层酚相 加入上层酚相 加入 0 1M0 1M 醋酸铵甲醇醋酸铵甲醇 液 剩余下层水相 加入下层水相 加入 TrisTris 饱和酚混匀饱和酚混匀 离心 13200rpm 15 20min 4 吸取上层酚相 加入 0 1M 醋酸铵甲醇 液 下层水相及杂质丢弃 和 20 沉淀过夜 4h 以 上 5 取沉淀过夜的样品重量平衡 离心 13200rpm 4 30min 倒掉上清 加入 6 8ml 冷丙酮混匀 20 沉淀 30min 离心 13200rpm 4 20min 弃上清 6 向沉淀中加 6 8ml 80 冷丙酮混匀 20 沉淀 20min 然后离心 13200rpm 4 30min 弃上清 2 7 转移沉淀到 1 5ml 离心管中 加 1ml 冷丙酮洗涤 离心沉淀两次 离心 0 5min 8 真空冰浴抽滤 干燥沉淀至干粉 80 低温保存 A 3 Tris HClTris HCl 提取缓冲液提取缓冲液 醋酸铵醋酸铵 甲醇提取法甲醇提取法 蝴蝶兰花瓣 白色 红色 蝴蝶兰花瓣 白色 红色 1 称取 1 0 g 花瓣 加入少许 PVP 液氮研磨 2 粉末转移至 10ml 离心管中 加 5 倍体积的 Tris HClTris HCl 提取缓冲液提取缓冲液和少量的 PMSF 摇匀 冰上悬 浮 10 min 离心 13200rpm 4 15min 3 取上清液加入预冷的 5 倍体积的 0 1M0 1M 醋酸铵甲醇醋酸铵甲醇 20 条件下沉淀过夜 4 取沉淀过夜的样品重量平衡 沉淀加入 10ml 0 1M 醋酸铵甲醇溶液洗涤 离心 13200rpm 4 15min 弃上清 该步骤重复 3 次 5 沉淀加入 10ml 预冷 80 丙酮洗涤 离心 13200rpm 4 15min 弃上清 该步骤重复 2 次 6 沉淀分装到 1 5ml 离心管中 加 1ml 冷丙酮洗涤 离心沉淀两次 离心 0 5min 7 真空冰浴抽滤 干燥沉淀至干粉 80 低温保存 A 4 蝴蝶兰花苞 两种方法 酚抽提法 蝴蝶兰花苞 两种方法 酚抽提法 Tris HClTris HCl 提取缓冲液提取缓冲液 醋酸铵醋酸铵 甲醇提取法 甲醇提取法 步骤见 A 2 和 A 3 试剂 试剂 TCATCA 丙酮 丙酮 10 TCA 0 07 巯基乙醇 以丙酮为溶剂 置于 20 冰箱保存 冷丙酮冷丙酮 含有 0 07 巯基乙醇的丙酮 置于 20 冰箱保存 80 80 冷丙酮 冷丙酮 80 丙酮 0 07 巯基乙醇 用双蒸水定容 置于 20 冰箱保存 0 1M0 1M 醋酸铵醋酸铵 甲醇 甲醇 醋酸铵 0 7708g 甲醇定容 Tris HClTris HCl 提取缓冲液提取缓冲液 酚抽提液 酚抽提液 蔗糖 23 96g 氯化钾 0 746g EDTA 1 461g Tris base 6 057g HCl0 25ml 双蒸水定容 巯基乙醇 2 v v 现用现加 置于 4 冰箱保存 Tris HClTris HCl 提取缓冲液提取缓冲液 0 1M Tris HCl pH 8 0 5 w v 蔗糖 2 w v SDS 5 v v 巯基乙 醇 2mM PMSF 4 保存 B B Brandford 法定量蛋白法定量蛋白 1 考马斯亮蓝考马斯亮蓝 G 250 试剂试剂 50mg 考马斯亮蓝 G 250 溶于 25ml 90 乙醇 加入 50 ml 85 正磷酸 用双蒸水定容到 500ml 2 标准蛋白溶液标准蛋白溶液 称取 10mg 牛血清白蛋白定容到 100ml 得到 100 g ml 的标准蛋白溶液 1ml 标 准溶液加 5ml 考马斯亮蓝 G 250 试剂 反应 2min 后测定 595nm 处吸光值 0123456 100 g ml 的标准蛋白溶液 ml 00 10 20 40 60 81 0 蒸馏水 ml 1 0 0 90 80 60 40 20 蛋白含量 g 01020406080100 A 595 e g 测得数据处理后 得线性标准曲线为 y 0 0074 x 0 0164 R2 0 997 一般 R2 0 995 定量较好 3 样品蛋白质含量测定样品蛋白质含量测定 10ul 蛋白质样品加水稀释到 1ml 加 5ml 考马斯亮蓝 G 250 试剂 反应 2min 后测定 595nm 处吸光值 根据标准曲线方程计算蛋白质含量 II 双向电泳双向电泳 第一部分第一部分 第一向等电聚焦 第一向等电聚焦 IEF 3 1 称取 15mg 蛋白质干粉加入约 300ul 1 20 水化液 根据方法适当调整干粉与水化液比例 混匀 30 绝对不能超过 33 防止蛋白氨甲酰化 水浴至少 1h 然后离心 13200rpm 15 40min 吸取上清 计体积 蛋白质浓度测定 吸取 10ul 样品测定 595nm 吸光值 根据标准曲线计算蛋白质浓度 2 取出 20 冷冻保存的 IPG 预制胶条 7cm pH3 10 NL 室温中放置 10 分钟 3 根据测定的蛋白质浓度 吸取适量样品 7cm 胶条蛋白上样量为 200 300ug 用水化液补足 180 l 上 样 4 沿着聚焦盘槽的边缘自左而右线性加入样品 在聚焦盘或水化盘两端各 1cm 左右不要加样 中间的样 品液一定要连贯 注意 不要产生气泡 否则影响到胶条中蛋白质的吸收和分布 5 用镊子去除 IPG 胶条上的保护层 将 IPG 胶条胶面朝下置于样品溶液 胶条的正极 标有 对应于 聚焦盘的正极并与电极紧密接触 不使胶条下面的溶液产生气泡 Bio rad GE Bio rad GE 标准胶条槽标准胶条槽 6 在每根胶条上覆盖约 1ml 矿物油 防止胶条水化过程中液体的蒸发 需缓慢的加入矿物油 沿着胶条 使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上 7 对好正 负极 盖上盖子 将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中 设置等电聚焦程序 7cm 胶条 水化50V20 12 h 主动水化 S1100V快速4 h除盐 S21000V线性1 h除盐 S34000V线性1 h升压 S44000V快速2 万 VH 聚焦 S5500V快速99 h 保持 选择所放置的胶条数 1 根 设置每根胶条的极限电流 50 A 根 设置等电聚焦时的温度 20 补充 补充 GEGE ManifoldManifold 胶条槽胶条槽 胶条被动水化 水化盘 水化步骤同主动水化 水化结束后的 IPG 胶条胶面朝上置于 Manifold 胶 条槽中 加滤纸盐桥 胶条的正极 标有 对应于聚焦盘的正极 活动电极压在滤纸并卡紧 设置电压 程序 同上 8 聚焦结束的胶条 立即进行平衡 第二向 SDS PAGE 电泳 否则将胶条置于样品水化盘中 20 冰 箱保存 试剂试剂 水化液水化液 10ml 尿素 Urea 8M 4 8g 硫脲 Thiourea 2M 1 52g CHAPS 4 v v 0 4g 0 001 w v 溴酚蓝 DTT 10mM 10ul 1M DTT 母液 IEF 上样前加入 IPG buffer 0 5 v v PH 3 10NL 和溴酚蓝 第二部分第二部分 胶条平衡胶条平衡 1 在桌上先放置干的厚滤纸 聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上 将另一份厚滤纸用双蒸水浸湿 然后直接置于胶条上 轻轻吸去胶条上的矿物油及多余样品 以减少凝胶染色时出现的纵条纹 2 将胶条胶面朝上胶面朝上转移至平衡盘中 加入 2 5ml2 5ml 平衡缓冲液平衡缓冲液 I I 将样品平衡盘放在水平摇床上平衡 15 分 钟 计时器计时 3 向另一个槽内加入 2 5ml2 5ml 胶条平衡缓冲液胶条平衡缓冲液 II 待第一次平衡结束后 胶条胶面朝上胶面朝上转移至平衡缓冲液 II 中 继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟 4 4 第二次平衡期间 将低熔点琼脂糖及 Marker 进行加热 6min 左右 试剂 试剂 平衡缓冲液平衡缓冲液 50mM Tris Hcl PH8 8 6m M 尿素 30 甘油 v v 2 SDS 0 002 溴酚蓝 平衡液平衡液 1 DTT 0 025g 2 5ml 平衡缓冲液 还原试剂 将 S S 键转化为 SH 平衡液平衡液 2 5 IAA 0 0625g 2 5ml 平衡缓冲液 烷基化试剂 中和 DTT 使组氨酸和半胱 氨酸烷基化 第三部分第三部分 第二向第二向 SDS PAGESDS PAGE 1 灌胶 配制 10ml 12 的丙烯酰胺凝胶 将溶液注入玻璃板夹层中 上部留约 0 5cm 的空间 用无水乙醇封面 保持胶面平整 聚合约 1h 12 PAGE 胶 mL 水 3 2 30 丙烯酰胺溶液 4 0 1 5 mol L Tris pH8 8 2 6 10 SDS0 1 10 过硫酸氨 Aps 0 1 TEMED0 004 2 倒去 SDS PAGE 凝胶上方玻璃板间多余的液体 用滤纸吸干 将处理好的第二向凝胶放在桌面上 长玻璃板在下 短玻璃板朝上 凝胶的顶部对着自己 3 第二次平衡结束后 取出胶条用滤纸吸取多余的平衡液 并完全浸没在 1 电泳缓冲液中 然后将胶 条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上 4 用镊子轻轻地将胶条向下推 使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触 加入已加热好的低熔点琼脂 不 要在胶条下方产生气泡 5 待低熔点琼脂糖凝胶完全凝固后 将凝胶转移到电泳槽中 在电泳槽加入电泳缓冲液后 防止产生气 泡 接通电源 7cm 胶板 12 连续 15mA 10min 30mA 1h 30min 7 电泳结束后 轻轻撬开两层玻璃 取出凝胶 并切角以作记号 8 改良考马斯亮蓝染色 参照 Candiano 等的方法略作改动 具体步骤为 1 清洗 用清水洗涤胶 5min 两次 2 染色 考马斯亮蓝 G 250 染色过夜 3 脱色 双蒸水清洗 2 次 双蒸水漂洗变浅至背景为无色 试剂 试剂 30 30 聚丙烯酰胺贮液 聚丙烯酰胺贮液 30 Acr Bis30 Acr Bis 丙烯酰胺 30g 甲叉 双丙烯酰胺 0 8g 用双蒸水定容至 100ml 滤膜过滤后 棕色瓶 4 冰箱保存 1 5mol L1 5mol L TrisTris 碱碱 pH8 8pH8 8 Tris 碱 18 15g 双蒸水 80ml 用 1mol L HCl 调 pH 至 8 8 加双蒸水定容至 100ml 滤膜过滤后 棕色瓶 4 冰箱保存 10 10 SDSSDS 10g SDS 溶于 100ml 双蒸水 滤膜过滤后 棕色瓶常温冰箱保存 10 10 Ap Ap 现用现配现用现配 10mg Ap 溶于 100ul 1 1 电泳缓冲液 电泳缓冲液 25mM Tris 192mM glycine 0 1 SDS Tris 碱3 03g 甘氨酸14 4g SDS 1g 双蒸水 1L 混匀后 室温保存 染色液染色液 0 12 考马斯亮蓝 G 250 10 硫酸铵 10 正磷酸 20 甲醇 后再加 25 甲醇 5 第四部分第四部分 图象扫描及分析图象扫描及分析 1 打开扫描仪 再打开计算机 将凝胶至于扫描仪上 用纯水小心湿润 使胶与扫描仪的玻璃板之间没 有气泡 并用纸巾小心吸干凝胶周围的水分 盖上上盖 准备进行扫描 2 预览确定扫描范围 调整扫描范围和扫描窗口大小 进行扫描 保存 一般是TIFF文件格式 3 扫描结束后 先用纸巾小心吸干大部分水分 再用擦镜纸小心的擦拭镜面 盖好盖子 关闭计算机和 扫描仪电源 4 用PDQuest分析软件分析 具体参照PDQuest 2 DAnalysis Software教程 单向单向 SDS PAGE 电泳电泳 1 样品复溶 样品复溶 称取 10mg 蛋白质干粉加入约 300ul 1 30 样品缓冲液混匀 85 水浴 5min 然后 13200rpm 15 20min 吸取上清 计体积 2 灌胶 灌胶 配制 8ml 丙烯酰胺分离胶和 3ml 浓缩胶 先将分离胶灌入玻璃板中 凝结 40min 然后将浓缩胶灌 入并插入梳子 凝结 30min 3 点样 点样 将单向电泳仪组装好 向内槽加上电泳缓冲液 小心拔出梳子 定量上样 每孔 10ul 液体 进行电 泳 电泳电泳程序 15mA 10min 30mA 1h20min 视电泳速度调整 4 拆板 拆板 电泳结束后 轻轻撬开两层玻璃 取出凝胶 并切角以作记号 5 染色染色 改良考马斯亮蓝 G 250 参照 Candiano 等的方法略作改动 具体步骤为 1 清洗 用清水洗涤胶 5min 两次 2 染色 考马斯亮蓝 G 250 染色过夜 3 脱色 双蒸水清洗 2 次 双蒸水漂洗变浅至背景为无色 试剂试剂 样品缓冲液 样品缓冲液 1 0M Tris Hcl PH6 8 1 6ml 10 SDS 4ml 87 甘油 2 5ml 溴酚蓝 0 4ml ME 1ml 先不加 超纯水定容到 20ml 4 长期保存 带分离胶的凝胶配方 带分离胶的凝胶配方 试剂试剂12 12 分离胶 共分离胶 共 8ml8ml 3 3 浓缩胶 浓缩胶 3ml3ml 双蒸水 2 562 11ml Acr Bis3 200 51 1 5mol LTris HClpH8 82 08 1 0mol LTris HClpH6 8 0 38 10 SDS0 080 03 10 AP0 080 03 TEMED0 0080 003 四 研究生分组和时间安排 1 参加 植物科学实验技术 的研究生分为四个大组 大家根据课程安排及自身情况自行调整 2 以大组为单位 进行双向电泳以及凝胶染色和图像分析 6 3 每位同学撰写一份实验报告 本学期结束后上交 便于成绩录入 4 三天 三天 制备样品制备样品 晚上 第二天上午 一向 单向一向 单向 上午 晚上 二向二向 第二天晚上 图像扫图像扫 描描 实验实验 LI 6400LI 6400 便携式光合仪测定植物便携式光合仪测定植物 兜兰兜兰 的光合日变化的光合日变化 一一 实验目的实验目的 1 了解 LI 6400 光合测量系统的工作原理 通过本实验掌握其基本操作 2 通过测定植物白天各时段光合速率的变化 绘制光合日变化曲线并分析 二二 实验原理实验原理 LI 6400 是一个开放系统 即光合和蒸腾的测量基于流动于叶室内气流中 CO2 H2O 的变化量 LI 6400 领先于传统开放系统的地方在于它将气体分析器安装于传感器头上 这样节省了气流到达传感器的 时间 检测速度的改进不是依赖于气流计 传统系统往往这样 并且严格准确地反映出叶片的变化 光 照的突然变化会导致光合速率的突然变化 这会由 CO2浓度的变化来检测到 三