WB实验步骤详细总结

1 9 蛋白提取 所有操作在冰上进行 1 裂解 1 配裂解液 PMSF 100 1 裂解液和 PMSF 在 20 保存 提前一天 4 解冻 取 2ml 裂解液 加 20 l PMSF 混匀 2 称取 30mg 组织 切碎放入标记好的 AP 管中 加入 600 l 上述 1 中液体 加入液 体与组织比例为 20 1 冰上静置 10min 2 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头 同时进行几组匀浆时 组间也要润洗钢头 在匀浆机 在生化室 上每次匀浆 10s 两次 间隔 5s 冰上静置 30min 3 离心 在基础 4 楼 416 室 1 自带 1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头 三个 1 5 的离心管 两个标记 加少 量超纯水 号是为了离心平衡 对称放置 2 将离心机预冷至 4 为止 以 1200 10r min 离心 15min 3 用移液枪将上层清液取出放入 号管中 4 变性 上样缓冲液 样品 4 1 将样品转移至 2 3 个 0 5mlAP 管中 加上样缓冲液 100 变性 10min 仪器屏幕 5 保存 变性结束后 打开 AP 管盖放一下气 然后 4 保存 点样是取出即可用 S5 00 10 S5 100 000 10 温度 时间 时 分钟 2 9 WB 实验步骤 1 清洗玻璃板 清洗玻璃板后风干 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧 操作时要使两玻璃 对齐 以免漏胶 2 配制分离胶 1 准备 1ml 枪 蓝色枪头 200 l 枪 黄色枪头 10 l 白色枪头 2 10 分离胶的配置 用 50ml 烧杯 1 0mm 板配 1 5 块胶 1 5mm 板配 2 块板 5 91ml 超纯水 4 95ml 丙烯酰胺 30 避光保存极易失效 3 75mlPh8 8Tris HCL 150 l 10 SDS 150 l AP 催化剂促凝作用 9 l TEMED 混合摇匀 用移液枪抽吸混匀液体 不要将液体完全打出防止气泡 3 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶 用 1ml 移液枪 不要将移液管内液体完全打出 防止气泡 保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4 水封 立即用 1ml 超纯水进行水封 利用重力把胶压平 如有气泡则用针头吸出防止影响 电泳效果 等待 20 30min 5 浓缩胶的配制 5 4 13ml 超纯水 1ml 丙烯酰胺 30 避光保存极易失效 750 l Ph6 8 Tris HCL 60 l 10 SDS 60 l AP 催化剂促凝作用 6 l TEMED 搅拌混匀立即灌胶至溢出 插入梳子 10 孔或 15 孔 凝胶 30min 或 20min 3 9 6 电泳 电泳液最多使用两次 1 安装电泳装置 低板对内 上方夹住 往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液 缓慢拔掉梳子 注意两手平衡 拔出防止拔歪 2 点样 不易时间过长 防止样品条带扩散 Mark 4 l Protern ladder 推荐 9 实际 4 已经足 够 样品 8 l 7 10 l 均可内参挑齐即可 组数少时尽量靠中间点样 边缘易跑歪 3 连接电泳仪 电泳池与电泳盖连接 黑对黑 红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内 打开开关恒压电泳 先调电压至 70mV 跑约 20min Mark 跑开 分出彩带即可 再调电压至 120mV 跑约 60min 不能跑过下面的玻璃板 注 Mark 的条带从红色条带往下依次为 70 55 40 35 20 待测蛋白的分子量再哪一区域就 在哪一段剪 用绿色的切板切割待测区域 边缘留点空余 以防止切到条带 放入装有转移液的皿 中浸泡 7 转膜 转移液可用 3 4 次 1 剪四层滤纸 大小与膜相 近可大不可小 浸入转移液皿中 然后再讲其剪成与胶一致大小 胶始 终保持湿润 2 剪 PVDF 膜 用上述滤纸 勿用手直接接触 PVDF 膜 然后用甲醇活化 10s 以上 3 夹三明治 再大塑料盆中加入少量转移液 将夹板 海绵 滤纸 膜均放入浸泡 夹板黑板在下 两层滤纸 胶 膜 两层滤纸 胶的大分子量条带在上方 即在右上方 4 安装转膜装置 黑板对黑板 电极黑对黑 红对红 加入转膜液至满 否则仪器无法启动 5 打开开关 调节电流至 100mA 转膜 2h 恒流 盆中加满冰 转膜成功标志 胶上的条带均转移的膜上 胶呈无色 8 封闭 1 配制 5 脱脂奶粉 2 5g 脱脂奶粉 50mlTBST 小烧杯中混匀加入皿中 4 9 2 将膜取出放入上述加入了 5 脱脂奶粉中的皿中常温慢摇 60min 转移液回收其余清理掉 转 移液可以重复利用 2 次 9 一抗 1 用 TBST 配 每一格加 5ml TBST 再分别加入抗体 抗体的量 2l Psmad2l 免抗 1 1000 5 l 5ml58 分子量 2l Psmad2l 免抗 1 500 10 l 5ml 58 Jnk 免抗 1 1000 5 l 5ml双带 内参 小鼠抗 GAPH 单抗 中杉金桥 1 5000 1 l 5ml 36 2 膜上用圆珠笔标记 分别放入小格中 正面朝上 3 4 冰箱中 慢摇过夜 正面朝上 摇床 416 室 10 洗脱 用 TBST 在皿中洗脱 摇床 10min 每次 洗三次 11 二抗 1 用 3 的脱脂奶粉 1 5g 的脱脂奶粉 50mlTBST 2 每格吸入 5ml 3 脱脂奶粉 抗体与奶粉比例均为 1 5000 即加入 1 l 注意 吸入微升时 一定要检查是否吸到液体 一抗用鼠抗则二抗用鼠抗 一抗用免抗二抗用 免抗 3 膜分别加入小格 慢摇 1 2h 常温 12 洗脱 用 TBST 在皿中洗脱 摇床 10min 每次 洗三次 小烧杯中混匀加入皿中 5 9 13 显影 U 盘 A 液 B 液 显影液 4 保存 200 l 枪 枪头 黄 膜 置于皿中 1 开机后自动预冷 温度降到 1 20 才可 2 显影液现配现用 A 液 B 液 1 1 3 膜正面朝上放于暗箱 即大分子量再左上角 用移液枪吧显影液均匀涂在膜上 4 先点击自动曝光 看下效果 显示不清晰再手动该曝光时间 内参一般显影 15s 影像的条带 粗细深浅一致则说明已调齐 内参好说明各步实验操作均