二代测序原理与技术(IonProton)

1 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential Ion Proton Sequencer 基研生物基研生物国内率先引进二代半测序平台国内率先引进二代半测序平台 2 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential Ion Proton System Ion Proton System的测序原理的测序原理 3 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 芯片就是测序仪芯片就是测序仪 半导体半导体测序测序 扩展迅速 反应灵敏扩展迅速 反应灵敏 符合半导体行业摩尔定律 通用试剂与测序芯片自由组合 测序速度快测序速度快 最快12小时测序时间 后光学原理 4 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential Ion Ion PI PI ChipChip Ion PI 芯片适用于全外显子组或全转录组测序芯片适用于全外显子组或全转录组测序 Ion PII 芯片适用于人类全基因组测序芯片适用于人类全基因组测序 165 M wells 10 Gb for 2 Exomes 目前实测 60 80M Filtered Reads 4 hours 660 M wells 20X human genome 目前实测 240 320M Filtered Reads Runs in Hours Ion Ion PII ChipPII Chip 5 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 测序原理简单测序原理简单 后光学原理后光学原理 直接检测氢离子 无需荧光检测直接检测氢离子 无需荧光检测 6 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 高通量芯片内进行测序反应高通量芯片内进行测序反应 Rothberg J M et al Nature doi 10 1038 nature10242 Sensor Plate Silicon Substrate Drain Source Bulk dNTP pH Q V Sensing Layer H 4种dNTP依次流过Ion芯片 DNA 聚合反应产生的氢离子的直接检测 每个碱基的检测只需要几秒 7 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 芯片示意图芯片示意图 8 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 1 依次掺入四种碱基依次掺入四种碱基 9 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 2 碱基配对结合碱基配对结合 10 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 3 释放氢离子释放氢离子 11 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 4 读取模版碱基读取模版碱基 12 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 5 连续两个相同碱基结合连续两个相同碱基结合 13 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 6 读取模版的连续两个相同碱基读取模版的连续两个相同碱基 14 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 7 芯片上几十万 几百万甚至上千万个芯片上几十万 几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息片段同时读取序列信息 15 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 7 芯片上几十万 几百万甚至上千万个芯片上几十万 几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息片段同时读取序列信息 16 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 新一代新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点半导体高通量测序平台原理及其特点 Ion Proton System的特点的特点 17 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 一天之内完成从样本制备到测序数据产生全部流程一天之内完成从样本制备到测序数据产生全部流程 Ion Proton OneTouch 2 System Ion Proton Sequencer Proton Torrent Server Ion Kits 18 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 测序速度快 随到随测测序速度快 随到随测 制备测 序文库 油包水油包水 相扩增相扩增 数据分析数据分析 收集纯收集纯 化磁珠化磁珠 上机测序上机测序 2小时 5小时小时 12小时小时 0 5小时小时 测序流程介绍测序流程介绍 19 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential Criteria Proton Hiseq 2000 测序原理测序原理 电位检测原理电位检测原理 光学检测原理光学检测原理 单端测序读长单端测序读长 200bp 还有提升空间 还有提升空间 100bp 数据准确性数据准确性 单次测序原始数据准确性单次测序原始数据准确性99 9 Hiseq2000公开的招标参数上描述单次测公开的招标参数上描述单次测 序原始数据准确性为序原始数据准确性为99 9 实验时间实验时间 1天 天 慢速模式 慢速模式 11天 天 快速模式 快速模式 40小时 小时 数据通量数据通量 PI 芯片 芯片 8 16G 2个个RNA样本即可开机测序 样本即可开机测序 PII 芯片芯片 32 64G 慢速模式 慢速模式 300G 60个个RNA样本即可开机样本即可开机 快速模式 最高快速模式 最高120G Ion Proton与与Hiseq2000技术指标比较技术指标比较 20 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 二代二代测序与芯片技术的比较测序与芯片技术的比较 每个小格是一簇长度每个小格是一簇长度 为为60bp长度探针 每长度探针 每 个探针鉴定一个基因个探针鉴定一个基因 的表达很亮 如果一的表达很亮 如果一 个基因表达量高 那个基因表达量高 那 么该小格所释放的荧么该小格所释放的荧 光强度越高 光强度越高 一条基因 一根探针 60bp 整个基因中 仅以与这整个基因中 仅以与这60bp探针互补杂探针互补杂 交到的基因表达量来代表整个基因的表交到的基因表达量来代表整个基因的表 达量 达量 基因芯片基因芯片 21 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 二代二代测序与芯片技术的比较测序与芯片技术的比较 二代测序二代测序 通过通过测序技术测序技术直接获直接获 得得这些基因的序列这些基因的序列片片 Reads 一一个基因表达量个基因表达量 越高 该基因测越高 该基因测 到的到的Reads数量数量 也越多 也越多 一条基因 一条Reads 100bp 2 0 16 0 6 2 7 Li Ji a n g f e n g 22 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 新一代新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点半导体高通量测序平台原理及其特点 数据处理数据处理 23 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential Raw Data预处理预处理 在在Mapping之前得到干之前得到干净净的的Reads 初步初步 过滤过滤 去接去接头头 去除低去除低质质 量序列量序列 随机随机 Blast 去除去除过过 短片段短片段 去除去除PCR Duplication 24 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 新一代新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点半导体高通量测序平台原理及其特点 数据后期处理数据后期处理 Mapping 率分析率分析统计结统计结果果 Per sequence quality scores 25 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 新一代新一代Ion半导体高通量测序平台原理及其特点半导体高通量测序平台原理及其特点 数据后期处理数据后期处理 26 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential Mapping回reference序列的reads数量 RPKM Reads Per Kilo bases per Million RPKM Reads Per Kilo bases per Million reads reads RPKM Mapping回referece序列的reads数量 该基因外显子长度 Total Exon Reads Exon Length X Mapped Reads million RPKM 27 Ion Torrent by Life Technologies Proprietary and Confidential 差异可变剪接筛选差异