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信号通路研究的技术方法 1 一 蛋白激酶磷酸化及其活性测定 二 蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定 三 DNA重组技术的应用 四 病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用 五 细胞信号分子特异性抑制剂的应用 六 细胞信号分子的荧光标记 七 细胞信号分子的三维结构分析 八 蛋白质与蛋白质相互作用的研究 九 报告基因技术 十 蛋白质与核酸相互作用技术 十一 对细胞内信号分子的干预技术 十二 信号分子基因表达检测技术 2 蛋白激酶磷酸化的检测 裂解培养的细胞获得裂解上清以免疫共沉淀法获得蛋白激酶SDS PAGE再加入蛋白激酶磷酸化特异性抗体以PhosphoAb HRPWestern化学发光检测试剂盒测定蛋白激酶的磷酸化程度 一 蛋白激酶磷酸化及其活性测定 3 经典蛋白激酶活性分析实验流程 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物和 32 ATP 激酶使底物磷酸化放射自显影 确定磷酸化条带 4 以免疫共沉淀法获得蛋白激酶加入该激酶底物 激酶使底物磷酸化再加入底物磷酸化特异性抗体以PhosphoAb HRPWestern化学发光检测试剂盒测定底物的磷酸化程度 进而推出蛋白激酶活性 非放射性蛋白激酶活性分析实验流程 5 较传统激酶活性测定方法的优点 无需接触放射性物质敏感度高 可以检测到每个磷酸化分子特异性 利用磷酸化特异性抗体可以进行位点特异性分析信噪比高低背景系统完整 提供一整套直接从细胞裂解液中测试酶活的试剂节约时间 由几天降到几分钟 6 Dynamicprocessesofp38activationbyLPSinRAWcells 7 EffectofindividualMAPKpathwaysonPRAKactivityinintactcells 8 ControlAniso ArseniteTNF 80kDa 47kDa 39kDa 80kDa 47kDa kDa97 4 68 0 43 9 29 0 18 4 14 3 ControlAniso ArseniteTNF A B Themajorkinasesofp38 andp38 9 P38MAPKinasePathway 10 PhosphopeptidemapofHSP27hosphorylatedbyPRAKinvitro 二 蛋白磷酸化位点分析及其功能鉴定 11 T182istheregulatoryphosphorylationsiteofPRAK 12 PCRprimer PCRprimer 三 DNA重组技术的应用活性诱变体无活性诱变体结构与功能的研究 13 14 TherelationshipbetweenthemembersofMAPKfamily 15 MAPKDuralPhosphorylationSitesL 12Length hp38DFGLARHTDD EMTGYVATRWYRAPE25hP38bDFGLARQADE EMTGYVATRWYRAPE25hp38gDFGLARQADS EMTGYVVTRWYRAPE25hp38dDFGLARHADA EMTGYVVTRWYRAPE25hJNK1DFGLARTAGTS FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK2DFGLARTACTN FMMTPYVVTRYYRAPE27hJNK3DFGLARTAGTS FMMTPYVVTRYYRAPE27hERK1DFGLARIADPEHDH TGFLTEYVATRWYRAPE31hERK2DFGLARVADPDHDH TGFLTEYVATRWYRAPE31hBMK1DFGMARGLCTSPAEH QYFMTEYVATRWYRAPE32YHOG1DFGLARIQDP QMTGYVSTRWYRAPE25YSMK1DFGLARGIHAGFFKCHS TVQPHITNYVATRWYRAPE36YMPK1DFGLARGYSENPVEN SQFLTEYVATRWYRAPE32YKSS1DFGLARCLASSSDSRET LVGFMTEYVATRWYRAPE35YFUS3DFGLARIIDESAADNSEPTGQQSGMTEYVATRWYRAPE38domainVIIVIII Loop 12 T Loop sequenceofMAPkinases 16 Constructionofp38loop 12toERKlikestructure p38 DFGLARHTDDE MTGYVATRWYRAPE p38 E DFGLARHTDDE MTEYVATRWYRAPE p38 6 DFGLARHTDDEHDHTGFMTGYVATRWYRAPE p38 6 E DFGLARHTDDEHDHTGFMTEYVATRWYRAPE p38 VAP DFGLARVADPE MTGYVATRWYRAPE p38 DL DFGLARHTDDD LTGYVATRWYRAPE p38 VAPD6 LE DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE ERK2 DFGLARVADPDHDHTGFLTEYVATRWYRAPE 17 MAPK MKK Substrates Loop 12isakeystructuretodeterminetheselectionofsubstrate TXY 18 四 病毒技术对于揭示细胞信号通路的作用腺病毒逆转录病毒 19 20 几种MAPK通路抑制剂的化学结构示意图 O NH2 OCH3 O PD98059 HN N S O F CH3 N OH N F N HN SB202190 SB203580 CH CH CH CH OH OCH3 OH OCH3 O O Curcumin 五 细胞信号分子特异性抑制剂的应用 21 EffectsofSB203580andPD98059onendogenousPRAKactivity 22 LPSEGFControl 六 细胞信号分子的荧光标记 23 24 25 LPS UV刺激心肌细胞共聚焦显微镜大体扫描 LPS Control UV 26 蛋白质三维结构分析对于揭示信号分子的功能的作用 七 细胞信号分子的三维结构分析 27 28 SH3 SH2 Kinase Src 蛋白激酶结构域 八 蛋白质与蛋白质相互作用的研究 29 1 蛋白质结合实验 30 2 免疫共沉淀实验 31 3 FRET和BRET 荧光能量共振转移 Fluorescenceresonanceenergytransfer 生物发光共振能量转移 bioluminescenceresonanceenergytransfer 32 4 酵母双杂合系统 33 IdentificationofMEF2Casasubstrateforp38 34 白细胞的渗出过程 35 5 噬菌体展示技术 36 九 报告基因技术研究细胞信号转导通路通过转录因子对基因启动子转录活性的影响 37 p38isinvolvedintheenhancementofTNF promotertransactivity 38 Inductionofc JunthroughMEF2Cphosphorylationbyp38 39 EMSA 十 蛋白质与核酸相互作用技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用 40 反义核酸技术的应用 十一 对细胞内信号分子的干预技术研究细胞内蛋白质尤其是转录因子与特定核酸序列的相互作用 41 RNAi 42 RNAi Figure1 Effectsofmex 3RNAinterferenceonlevelsoftheendogenousmRNA NomarskiDICmicrographsshowinsituhybridizationof4 cellstageembryos A Negativecontrolshowinglackofstainingintheabsenceofthehybridizationprobe B Embryofromuninjectedparentshowingnormalpatternofendogenousmex 3RNA purplestaining C Embryofromparentinjectedwithpurifiedmex 3antisenseRNA Theseembryos andtheparentanimals retainmex 3mRNA althoughlevelsmaybesomewhatlessthanwildtype D Late4 cellstageembryofromaparentinjectedwithdsRNAcorrespondingtomex 3 nomex 3RNAisdetecte