微生物的遗传变异与菌种选育.ppt

第5章微生物的遗传变异与菌种选育 5 1微生物遗传变异的物质基础5 2微生物的基因突变5 3微生物的基因重组5 4微生物的菌种选育5 5微生物菌种的保藏和复壮 微生物是现代遗传学 分子生物学和其它许多重要的生物学基础研究中最热衷选用的模式生物 研究微生物遗传学的意义 为什么进化的速度以及复杂性变得越来越快 根据化石记录显示 单细胞生物于35亿年前首次出现在地球上 但是之后它们用了大约25亿年进化成多细胞生物 剩下的10亿年却发展成了植物 哺乳动物 昆虫 鸟类等各种各样的地球物种 Rice大学科学家的研究结果可望解决这一问题 他们认为生物进化速度的加快是因为细菌和病毒不断在不同物种之间传递DNA 如果没有这种作用 只依靠基因突变和两性选择作用是不会达到如此快速度的 对微生物遗传规律的深入研究 不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展 而且为育种工作提供了丰富的理论基础 促使育种工作从不自觉到自觉 从低效到高效 从随机到定向 从近缘杂交到远缘杂交的方向发展 在应用微生物加工制造和发酵生产各种食品的过程中 要想有效地大幅度提高产品的产量 质量和花色品种 首先必须选育优良的生产菌种 才能达到目的 优良菌种的选育是在微生物遗传变异的基础上进行的 遗传和变异是相互关联 同时又相互矛盾对立的两个方面 在一定条件下 二者是相互转化的 遗传与变异的概念 遗传和变异是生物体的最本质的属性之一 遗传 heredity 亲代生物的性状在子代得到表现 亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息 特点 具稳定性 遗传型 genotype 又称基因型 指某一生物个体所含有的全部基因的总和 是一种内在可能性或潜力 遗传型 环境条件表型表型 phenotype 指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和 是一种现实存在 是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状 变异 variation 生物体在外因或内因的作用下 遗传物质的结构或数量发生改变 特点 a 在群体中出现几率极低 一般为10 6 10 10 b 形状变化的幅度大 c 变化后形成的新性状是稳定的 可遗传的 饰变 modification 指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录 转译水平上的表型变化 特点是 a 几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化 b 性状变化的幅度小 c 因遗传物质不变 故饰变是不遗传的 引起饰变的因素消失后 表型即可恢复 遗传与变异的概念 5 1微生物遗传变异的物质基础 种质连续理论 1883 1889年间Weissmann 魏斯曼 提出 认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物 基因学说 二十世纪初发现了染色体并提出基因学说 使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上 染色体由核酸和蛋白质两种长链高分子组成 20多种氨基酸经过不同排列组合 可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字 而核酸的组成却简单得多 一般仅由4种不同的核苷酸组成 它们通过排列组合只能产生较少种类的核酸 因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因 起活性成分是蛋白质 DNA是遗传变异的物质基础的证明 1944年以后 利用微生物为实验对象进行的三个著名实验 肺炎球菌的转化试验 噬菌体感染试验 病毒的拆开与重建试验 证明核酸是遗传变异物质基础的经典实验 5 1 1肺炎双球菌转化实验 transformation 1928年 英国医学微生物学家格里菲斯 f griffith 发现肺炎球菌的转化现象 研究对象 Streptococcuspneumoniae 肺炎双球菌 S型菌株 有致病性 菌落表面光滑 有荚膜R型菌株 无致病性 菌落表面粗糙 无荚膜 图5 1肺炎双球菌动物转化试验 1928年 格里菲斯 f griffith 进行了以下几组实验 1 动物实验对小鼠注射活R菌或死S菌 小鼠存活对小鼠注射活S菌 小鼠死亡对小鼠注射活R菌和热死S菌 小鼠死亡 2 细菌培养实验热死S菌 不生长活R菌 长出R菌热死S菌 活R菌 长出大量R菌和10 6S菌 3 S型菌的无细胞抽提液试验活R菌 S菌无细胞抽提液 长出大量R菌和少量S菌 以上实验说明 加热杀死的S型细菌细胞内可能存在一种转化物质 它能通过某种方式进入R型细胞并使R型细胞获得稳定的遗传性状 加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖 活R菌 长出S菌 只有R菌 1944年O T Avery 埃弗里 C M MacLeod 麦克劳德 和M McCarty 麦卡蒂 从热死S型肺炎球菌S pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分 在离体条件下进行了转化试验 只有S型细菌的DNA才能将肺炎球菌S Pneumoniae的R型转化为S型 且DNA纯度越高 转化效率也越高 说明S型菌株转移给R型菌株的 是遗传因子 5 1 1 2噬菌体的感染实验 A D Hershey 赫西 和M Chase 蔡斯 1952年 1 含32P DNA的一组 放射性85 在沉淀中 2 含35S 蛋白质的一组 放射性75 在上清液中所以 进入细胞的是噬菌体的核酸而不是蛋白质 5 1 1 3烟草花叶病毒的拆开与重组实验 为了证明核酸是遗传物质 弗伦克尔 康拉特 H Fraenkel Conrat 1956 用含RNA的烟草花叶病毒 TMV 进行了著名的植物病毒重建实验 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡 就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离 分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下 也能感染烟草并使其患典型症状 而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子 选用烟草花叶病毒 TMV 和霍氏车前花叶病毒 HRV 分别拆分取得各自的RNA和蛋白质 将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒 1 RNA TMV 蛋白质 HRV 2 RNA HRV 蛋白质 TMV 用两种杂合病毒感染寄主 1 表现TMV的典型症状病分离到正常TMV粒子 2 表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子 上述结果说明 在RNA病毒中 遗传的物质基础也是核酸 5 1 1 3烟草花叶病毒的拆开与重组实验 图5 4TMV重建实验示意图 DNA的组成元素 脱氧核苷酸 规则的双螺旋结构 5 1 2DNA结构与复制 DNA的基本单位 DNA的多样性 DNA的特异性 DNA的空间结构 5 1 2 1DNA的结构 脱氧核苷酸的结构与种类 脱氧核苷酸 脱氧核苷酸种类 腺嘌呤脱氧核苷酸 鸟嘌呤脱氧核苷酸 胞嘧啶脱氧核苷酸 胸腺嘧啶脱氧核苷酸 DNA的空间结构 规则的双螺旋结构 1953年由沃森和克里克提出 1 DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构 2 脱氧核糖与磷酸交替连结 排列在外侧 构成基本骨架 碱基排列在链的内侧 3 两条链上的碱基通过氢键连结起来 形成碱基对 碱基对的组成有特定的规律 即腺嘌呤一定与胸腺嘧啶配对 鸟嘌呤一定同胞嘧啶配对 DNA就是脱氧核糖核酸 长链 腺嘌呤 A 鸟嘌呤 G 胸腺嘧啶 T 胞嘧啶 C A T C G A A A T T T T T T A A A G G G G G C C C C C G C 基因测序就是读出A C G T G G A C G 每条多核苷酸链上均有四种碱基的结构 利用碱基互补配对规律的计算 5 1 2 1DNA的结构 规律一 DNA双链中的两条互补链的碱基相等 任意两个不互补的碱基之和恒等 占碱基总数的50 即 A G T C A C T G 50 A G T C A C G T T C A G 1 规律二 在DNA双链中的一条单链的A GT C的值与另一条互补链的T CA G的值互为倒数关系 规律三 DNA双链中 一条单链的A TG C的值与另一条互补链的A TG C的值是相等的 也与整个DNA分子中的A TG C的值相等 复制的时期 复制的场所 复制的模板 原材料 基本条件 复制过程 复制特点 遵循原则 5 1 2 2DNA的复制 5 1 2 3RNA 核糖核酸 缩写为RNA 存在于生物细胞以及部分病毒 类病毒中的遗传信息载体 由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸 因含核糖而得名 简称RNA RNA普遍存在于动物 植物 微生物及某些病毒和噬菌体内 RNA和蛋白质生物合成有密切的关系 在RNA病毒和噬菌体内 RNA是遗传信息的载体 RNA一般是单链线形分子 也有双链的如呼肠孤病毒RNA 环状单链的如类病毒RNA 1983年还发现了有支链的RNA分子 5 1 2 3RNA RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子 一个核糖核苷酸分子由磷酸 核糖和碱基构成 RNA的碱基主要有4种 即A腺嘌呤 G鸟嘌呤 C胞嘧啶 U尿嘧啶 其中 U 尿嘧啶 取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基 5 1 2 3RNA 与DNA不同 RNA一般为单链长分子 不形成双螺旋结构 但是很多RNA也需要通过碱基配对原则形成一定的二级结构乃至三级结构来行使生物学功能 RNA的碱基配对规则基本和DNA相同 不过除了A U G C配对外 G U也可以配对 5 1 2 3RNA 在细胞中 根据结构功能的不同 RNA主要分三类 即tRNA 转运RNA rRNA 核糖体RNA mRNA 信使RNA mRNA是合成蛋白质的模板 内容按照细胞核中的DNA所转录 tRNA是mRNA上碱基序列 即遗传密码子 的识别者和氨基酸的转运者 rRNA是组成核糖体的组分 是蛋白质合成的工作场所 核糖核酸 5 1 3遗传物质存在方式 1 细胞水平从细胞水平看 无论是原核微生物还是真核微生物 遗传物质全部或大部分DNA都集中在细胞核或核区中 不同的微生物细胞或是同种微生物的不同类型细胞中 细胞核的数目是不同的 在细菌和酵母菌中 尽管在高速生长阶段出现多核现象 但最终一个细胞只有一个核 部分霉菌和放线菌的菌丝细胞往往是多核的 在真核微生物的细胞核中 DNA与蛋白质结合在一起形成染色体 外包裹一层核膜 从而构成的在光学显微镜下清晰可见的完整细胞核 如霉菌 酵母菌 藻类和原生动物等 而原核微生物的细胞核无核膜 DNA在细胞内以核质体的形式存在 如细菌 放线菌和蓝细菌等 也有人把没有细胞结构的病毒称为原核微生物 5 1 3遗传物质存在方式 真核微生物的每个细胞核中的染色体数目较多 且其数目随着种类的不同而不同 而原核微生物中 核区只有一个由裸露的DNA构成的 光学显微镜下无法看到的 一般呈环状的染色体 除此之外 染色体的套数也有不同 如果在一个细胞中只有一套相同功能的染色本 它就是一个单倍体 在自然界中发现的微生物 多数都是单倍体 高等动植物的性细胞都是单倍体 反之 包含着两套相同功能染色体的细胞 就称双倍体 如高等动植物的体细胞 少数微生物 如啤酒酵母 的营养细胞及由两个单倍体的性细胞接合或体细胞结合后所形成的合子等都是双倍体 5 1 3遗传物质存在方式 2 分子在细胞核中 微生物的遗传物质是核酸 除部分病毒 大多数为植物病毒 的遗传物质是RNA外 大多数微生物的遗传物质是DNA 即在DNA大分子上存在着决定某些遗传性状的特定区段 基因 它的物质基础是一个具有特定核苷酸顺序的核酸区段 一个基因是由若干个核苷酸碱基组成的三联密码子所构成的 生物体内的无数蛋白质是生物体各种生理功能的执行者 但是蛋白质并不能自我复制 它是由DNA分子结构上的遗传信息来合成的 5 1 3遗传物质存在方式 其过程是首先通过转录作用将DNA上的遗传信息转录到mRNA上去 形成一条与DNA碱基互补的mRNA链 然后再通过转译作用由mRNA上的三联密码顺序去决定蛋白质上的氨基酸的排列顺序 这一过程就是转录与翻译 DNA上的特定的核苷酸排列如同遗传密码 负载了所有的遗传信息 基因实际上是一个具有遗传功能的核酸片段 密码子则是遗传信息的信息单位 而构成核酸的基本单位则是核苷酸 在绝大多数生物的DNA中 都只有四种核苷酸 它们之间唯一区别就是具有四种不同的碱基 5 1 3遗传物质存在方式水平 5 2微生物的基因突变 基因突变指生物体内的遗传物质发生了稳定的可遗传的变化 它包括基因突变和染色体畸变 在微生物中 基因突变是最常见 最重要的 5 2 1基因突变的类型 1 营养缺陷型指微生物经基因突变引起的代谢障碍而必须添加某种营养物质才能正常生长的突变型 这种突变型在科研和生产中具有重要的应用价值 5 2 1基因突变的类型 2 条件致死突变型指微生物经基因突变后 在某一条件下呈现致死效应 而在另一种条件下却不表现致死效应的突变型 如温度敏感突变型 3 形态突变型指由于突变而引起的细胞形态变化或菌落形态的改变的非选择变异 如孢子有无 孢子颜色 鞭毛有无 荚膜有无 菌落的大小 外形的光滑 粗糙等 4 抗性突变型由于基因突变而使原始菌株产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性的变异类型 根据其抵抗的对象又分抗药性 抗紫外线 抗噬菌体等突变类型 这些突变类型在遗传学研究中非常有价值 常被用作选择性标记菌种 3 形态突变型 菌落变异 细菌的菌落主要有光滑 smooth S 型和粗糙 rough R 型两种 S型菌落表面光滑 湿润 边缘整齐 经人工培养多次传代后菌落表面边为粗糙 干燥 边缘不整齐 称S R变异 粗糙型菌落 光滑型菌落 5 2 1基因突变的类型 5 产量突变型通过基因突变而获得有用的代谢产物在产量上高于原始菌株的突变株 也称高产突变株 这在发酵食品生产及抗生素生产中十分重要 但由于产量性状是由许多遗传因子决定的 因此产量突变型的突变机制是很复杂的 产量的提高也是逐步积累的 产量突变型实际上有两种类型 一类是某代谢产物比原始菌株有明显提高的 可称为 正突变 另一类是产量比其亲本有所降低 即称为 负突变 6 其他突变型如毒力 糖发酵能力 代谢产物的种类和数量以及对某种药物的依赖等的突变型 5 2 2突变的特点1 不对应性 突变的性状与突变原因之间无直接的对应关系 变量试验 涂布试验 平板影印培养试验 2 自发性 突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生 3 稀有性 突变率低且稳定 4 独立性 各种突变独立发生 不会互相影响 5 可诱发性 诱变剂可提高突变率 6 稳定性 变异性状稳定可遗传 7 可逆性 原始的野生基因到变异株的突变称为正向突变 相反的过程则称为回复突变或回变 5 2 3基因突变的机制 5 2 3 1自发突变的机制自发突变是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变 随诱变机制的研究 对自发突变的原因已有所认识 下面讨论几种自发突变的可能机制 1 背景辐射和环境因素的诱变不少 自发突变 实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素长期的综合效应导致 例如充满宇宙空间的各种短波辐射 高温的诱变效应以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等 5 2 3 1自身突变的机制 2 微生物自身有害代谢产物的诱变过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物 它对脉孢菌具有诱变作用 这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低 如果同时再加入过氧化氢酶抑制剂 则又可提高突变率 这就说明 过氧化氢可能是自发突变中的一种内源诱变剂 在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株 可能也是同样的原因 3 由DNA复制过程中碱基配对错误引起据统计 DNA链每次复制中 每个碱基对错误配对的频率是10 7 10 11 而一个基因平均约含1000bp 故自发突变频率约为10 6 因此 若对细菌做一般液体培养时 因其细胞浓度常可达到108个 ml 故经常会在其中产生自发突变株 自身突变的机制 背景辐射和环境因素的诱变微生物自身有害代谢产物的诱变由DNA复制过程中碱基配对错误引起互变异构效应环状突出效应 5 2 3 1自身突变的机制 4 互变异构效应碱基T G的第六位上是酮基 会以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现C A的第六位上是氨基 会以氨基式或亚氨基式两种互变异构的状态出现平衡一般趋向于酮式或氨基式 在DNA双链结构中一般总是以A T和G C碱基配对的形式出现在偶然情况下 在DNA复制到达这一位置的瞬间 在T以稀有的烯醇式出现时 其相对位置上就出现G同样 如果C以稀有的亚氨基形式出现在DNA复制到达这一位置的瞬间 则在新合成DNA单链中与C相对应的位置上就将是A 这可能就是发生相应的自发突变的原因 要预言在某一时间 某一基因发生自发突变是不可能的 在运用数学方法对这些偶然事件做大量统计分析后 可以发现并掌握其中的规律 5 2 3 1自身突变的机制5 环出效应 即环状突出效应 有人提出 在DNA的复制过程中 如果其中某一单链上偶然产生一个小环 则会因其上的基因越过复制而发生遗传缺失 从而造成自发突变 下图就是环出效应的设想机制 在上链中 标记B处发生 环出 故只有A及C能获得复制 从而发生自发突变 而在下链中 复制仍正常进行 5 2 3 2诱发突变的机制 诱变剂 mutagen 凡能提高突变率的任何理化因子 诱变剂的种类很多 作用方式多样 即使是同一种诱变剂 也常有不同的作用方式 5 2 3基因突变的机制 1 碱基置换 substitution 定义 对DNA来说 碱基的置换属于一种染色体的微小损伤 microlesion 一般也称点突变 pointmutation 它只涉及一对碱基被另一对碱基所置换 分类 转换 transition 即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换 颠换 transversion 即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换 对某一具体诱变剂来说 可同时引起转换与颠换 也可只具其中的一种功能 根据化学诱变剂是直接还是间接地引起置换 可把置换的机制分成以下两类来讨论 直接引起置换的诱变剂 一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂 例如亚硝酸 羟胺和各种烷化剂 硫酸二乙酯 甲基磺酸乙酯 N 甲基 N 硝基 N 亚硝基胍 N 甲基 N 亚硝基脲 乙烯亚胺 环氧乙酸 氮芥等 它们可与一个或几个核苷酸发生化学反应 从而引起DNA复制时碱基配对的转换 并进一步使微生物发生变异 在这些诱变剂中 除羟胺只引起G C A T外 其余都是可使G CA T发生互变的 能引起颠换的诱变剂很少 只是部分烷化剂才有 2 移码突变 移码突变 frame shiftmutation 指诱变剂使DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添 插入 或缺失 从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变 由移码突变所产生的突变株 称为移码突变株 frameshiftmutant 与染色体畸变相比 移码突变也只能算是DNA分子的微小损伤 能诱发移码突变的几种代表性化合物 引起移码突变的诱变剂 主要是吖啶类染料 如吖啶黄 吖啶橙等等 这类化合物都是平面型的三环分子 它们的结构与一个嘌呤 嘧啶对十分相似 丫啶类化合物的诱变机制 至今还不很清楚 有人认为 由于它们是一种平面型三环分子 结构与一个嘌呤 嘧啶对十分相似 故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间 造成双螺旋的部分解开 两个碱基对原来相距0 34nm 当嵌入一个丫啶分子时 就变成0 68nm 从而在DNA复制过程中 会使链上增添或缺失一个碱基 结果就引起了移码突变 丫啶类化合物诱发的移码突变及其回复突变图示 3 染色体畸变 chromosomalaberration 某些理化因子 如X射线等的辐射及烷化剂 亚硝酸等 除了能引起点突变外 还会引起DNA的大损伤 macrolesion 染色体畸变 它包括 染色体结构上的变化 缺失 deletion 重复 duplication 易位 translocation 倒位 inversion 染色体数目的变化 染色体结构上的变化 染色体内畸变只涉及一条染色体上的变化 如发生染色体的部分缺失或重复时 其结果可造成基因的减少或增加 又如发生倒位或易位时 则可造成基因排列顺序的改变 但数目却不改变 倒位是指断裂下来的DNA片段旋转180 后 重新插入到原来染色体的位置上 易位则指断裂下来的一小段染色体再顺向或逆向地插入到同一条染色体的其它部位上 染色体间畸变 则指非同源染色体间的易位 染色体畸变 紫外线 U V ultravioletray 对DNA的损伤 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多 嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物 其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻胸腺嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体 它的出现会减弱双链间氢键的作用 并引起双链结构扭曲变形 阻碍碱基间的正常配对 从而引起突变或死亡 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少 但一旦形成 就会妨碍双链的解开 因而影响DNA的复制和转录 并使细胞死亡 紫外线对DNA的损伤及其修复 已知的DNA损伤类型很多 机体对其修复的方式也各异 发现较早和研究得较深入的是紫外线 U V ultravioletray 的作用 嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多 嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物 其中了解较清楚的是胸腺嘧啶二聚体的形成和消除 紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体 二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用 并引起双链结构扭曲变形 阻碍碱基间的正常配对 从而有可能引起突变或死亡 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少 但一旦形成 就会妨碍双链的解开 因而影响DNA的复制和转录 并使细胞死亡 光复活作用 photoreactivation 定义 经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时 可明显降低其死亡率的现象 称为光复活作用 经紫外线照射后形成的带有胸腺嘧啶二聚体的DNA分子 在黑暗下会被一种光激活酶 photoreactivatingenzyme 即光裂合酶结合 当形成的复合物暴露在可见光 300 500nm 下时 此酶会因获得光能而发生解离 从而使二聚体重新分解成单体 与此同时 光激活酶也从复合物中释放出来 以便重新执行功能 每一E coli细胞中约含有25个光激活酶分子 由于一般的微生物中都存在着光复活作用 所以进行紫外线诱变育种时 只能在红光下照射及处理照射后的菌液 图 光复活作用 暗修复作用 darkrepair 又称切除修复 excisionrepair 是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂 包括烷化剂 X射线和 射线等 损伤后的DNA的机制 这种修复作用与光无关 有四种酶参与 内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5 一侧切开一个3 OH和5 P的单链缺口 外切核酸酶从5 P至3 OH方向切除二聚体 并扩大缺口 DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板 从原有链上暴露的3 OH端起逐个延长 重新合成一段缺失的DNA链 通过连接酶的作用 把新合成的寡核苷酸的3 OH末端与原链的5 P末端相连接 从而完成了修复作用 暗修复作用 darkrepair 1 由核酸内切酶切开二聚体的5 末端 形成3 OH和5 P的单链缺口2 核酸外切酶从5 P到3 OH方向切除二聚体 并扩大缺口 3 DNA聚合酶以另一条互补链为模板 从原有链上暴露的3 OH端起合成缺失片段 4 连接酶将新合成的3 OH与原有的5 P相连接 设备 紫外灯 磁力搅拌器 暗室等 紫外灯 波长为253 7nm 功率是15W处理时的照射距离 20cm 30cm样品 要直接暴露在紫外灯下 厚度不能超过3mm照射时 要用磁力搅拌器搅拌 处理剂量 常用照射时间或死亡率作为相对剂量 紫外诱变方法 由于微生物接受的照射剂量与灯的功率 照射距离 照射时间 菌液浓度 菌液厚度 细胞本身特性等因素有关 所以单纯用时间表示照射剂量并不完全可靠 一定的死亡率必定对应一定的照射剂量 所以 在实际应用中 用死亡率表示照射剂量更可靠 通常先绘制照射时间与死亡率的关系曲线 然后选择合适的剂量 生产上经常采用的剂量 死亡率为70 80 左右 重组修复 必须在DNA复制的情况下进行 所以又叫复制后修复 细胞在不切除二聚体的情况下 以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链 但在每个二聚体附近留有一空隙 通过染色体交换 空隙部位就不在面对着胸腺嘧啶二聚体 而是面对着正常的单链 在这种条件下 DNA聚合酶和连接酶起作用将空隙部位进行修复 重组修复中的DNA损伤并没有去除 但随着微生物的传代繁殖 损伤的比例逐渐降低 SOS 修复 SOS 为国际通用的呼救信号 为 saveoursoul 的缩写 SOS 修复是指细胞处于危急状态 即DNA分子受到大范围损伤 而复制又受到抵制的情况 受到损伤的DNA发出信号 诱导 SOS 修复酶对DNA损伤进行修复 5 3微生物的基因重组 基因重组又称为遗传重组 它是指把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起 经过遗传分子的重新组合后 形成新遗传型个体的过程 重组是分子水平上的概念 可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交 而一般所说的杂交是细胞水平上的概念 杂交中必然包含着重组 而重组则不限于杂交一种形式 真核微生物中的有性杂交 准性生殖以及原核微生物中的转化 转导 接合和溶原转变等都是基因重组在细胞水平上的反映 5 3 1原核微生物的基因重组5 3 1 1转化 transtormation 转化过程 从供体菌提取出转化因子双链DNA片段 双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合 在结合位点上 双链DNA中的一条单链逐步降解 同时另一条链逐步进入受体细胞 进入受体细胞的DNA单链与受体菌染色体组上同源区段配对 而受体菌染色体组的相应单链片段被切除 并被进入受体细胞的DNA单链所取代 于是形成了杂种DNA区段 受体菌染色体进行复制 其中杂种区段被分离成两个 一个恢复 一个形成一个转化子 受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段 通过交换组合把它整合到自己的基因组中 从而获得了供体菌的部分遗传性状的现象 称为转化 转化后的受体菌 称为转化子 供体菌的DNA片段称为转化因子 只有处于感受态的细菌才能接受转化因子 进行转化作用 5 3 1 1转化 5 3 1 2转导 transduction 转导是以噬菌体为媒介 把一个菌株的遗传物质导入另一个菌株 并使这个菌株获得另一个菌株遗传性状 转导又分为普遍性转导和特异性转导 普遍性转导 generalizedtransduction 是指转导型噬菌体能传递供体菌株任何基因 如大肠杆菌P1噬菌体 伤寒沙门氏菌的P22噬菌体等都能进行普遍性转导 它的转导频率为10 5 10 8 能进行普遍转导的噬菌体 含有一个使供体菌株染色体断裂的酶 5 3 1 2转导 transduction 当噬菌体DNA被噬菌体蛋白外壳包裹时 正常情况下 是将噬菌体本身的DNA包裹进蛋白衣壳内 但也有异常情况出现 供体染色体DNA 通常和噬菌体DNA长度相似 偶然错误地被包进噬菌体外壳 而噬菌体本身的DNA却没有完全包进去 装有供体染色体片段的噬菌体称为转导颗粒 转导颗粒可以感染受体菌株 并把供体DNA注入受体细胞内 与受体细胞的DNA进行基因重组 形成部分二倍体 通过重组 供体基因整合到受体细胞的染色体上 从而使受体细胞获得供体菌的遗传性状 产生变异 形成稳定的转导子 5 3 1 2转导 transduction 特异性转导 specializedtransduction 是指温和噬菌体侵染而形成的某一溶源细菌群被诱导裂解时 其中极少数个体的DNA可能与噬菌体的DNA发生若干特定基因转换 从而被整合到噬菌体的基因组上 当该噬菌体周到次感染受体细胞时 就使受体细胞获得了这一特定遗传现象 它的转导频率为10 6 特异性转导是在大肠杆菌K12的温和型噬菌体中被首次发现的 5 3 1 3接合 conjugation 通过供体细菌和受体细菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程 称为接合 有时也称杂交 在细菌中 接合现象研究最清楚的是大肠杆菌 发现能够进行接合现象的大肠杆菌有雄性与雌性之分 而决定它们性别的是由是否存在F因子所决定 F因子又称致育因子 是一种质粒 分子量为5 107道尔顿雌性细菌不含F因子 称为F 菌株 雄性细菌含有游离存在的F因子 称为F 菌株 当雄性细菌细胞中所含的F因子被整合在细胞核的DNA上 不呈游离状态存在称为Hfr菌株 高频重组菌株 有时被整合在细胞核DNA上的F因子 从DNA上面脱落下来 呈游离存在 但在脱落时 F因子有时能带一小段细胞核DNA 我们将这种含有游离存在的但又带有一小段细胞核DNA的F因子的细菌称为F 菌株 接合的结果雄性菌株与雌性菌株接合时 将产生三种不同的结果 F 菌株与F 菌株接合的结果是产生两个F 其接合过程为 F 菌株的F因子的一条DNA单链在特定的位置上发生断裂 断裂的单链逐渐解开 同时留下另一条环状单链为模板 通过模板的旋转 一方面解开的一条单链通过性纤毛而推入F 菌株中 另一方面 又在供体细胞内 重新组合成一条新的环状单链 以取代解开的单链 此即为滚环模型 在F 菌株细胞中 外来的供体DNA单链上也合成一条互补的新DNA链 并随之恢复成一条环状的双链F因子 这样 F 就变成了F 菌株 接合的结果 F 菌株与F 接合产生二个F 菌株 F F F F Hfr菌株 高频重组菌株 与F 菌株接合的情况比较复杂 接合结果也不完全一样 在大多数情况下 受体细菌仍是F 菌株 只有在极少数情况下 由于遗传物质转移的完整 受体细胞才能成为Hfr菌株 其原因如下 当Hfr菌株与F 菌株发生接合时 Hfr染色体在F因子处发生断裂 由环状变成线状 紧接着 由于F因子位于线状染色体之后 处于末端 所以必然要等Hfr的整条染色体全部转移完后 F因子才能进入到F 细胞 接合的结果 而由于一些因素的影响 在转移过程中 Hfr染色体常常发生断裂 因此Hfr菌株的许多基因可以进入F 菌株 越是前端的基因 进入的机会越多 在F 菌株中出现重组子的时间就越早 频率也高 而对于F因子 其进入F 菌株的机会很少 引起性别变化的可能性也非常小 这样Hfr与F 菌株接合的结果重组频率虽高 但却很少出现F 菌株 总之 通过Hfr菌株与F 菌株接合 在大多数情况下 受体细菌仍然是F 菌株 只有在极少数情况下 由于遗传物质转移完整 受体细胞才能成为Hfr菌株 Hfr F Hfr F Hfr F Hfr Hfr 5 3 1 4溶源性转变 宿主菌在感染温和噬菌体后 由于噬菌体DNA整合到核DNA后 导致宿主菌某些新的遗传性状表达 即所谓溶源性转变 这是一种与转导相似但又有本质不同的现象 溶源转变与转导在本质上的不同 首先是它的温和噬菌体不携带有任何供体菌的基因 其次这种噬菌体是正常的完整的 而不是异常情况下产生的缺陷型噬菌体 溶源转变的典型例子是不产毒素的白喉棒状杆菌 Lorynebatceriumdiphthariac 菌株被噬菌体侵染而发生溶源化时 会变成产毒素的致病菌株 其他如沙门氏菌 红霉菌 链霉菌等也具有溶源转变的能力 5 3 2噬菌体的基因重组 噬菌体原来指细菌病毒 近年来发现真菌 藻类都有噬菌体 病毒属于原核生物 是化学成份最简单的生物 它没有一般的细胞结构 它的染色体和细菌一样并不和蛋白质结合在一起 它具有寄生专一性 只能在寄主细胞内繁殖 它可以离开寄主细胞而存活 可是不能繁殖 由于病毒的简单的体制和它与寄主细胞的特殊关系 它已成为分子遗传学研究中最普遍采用的材料之一 病毒的研究对认识遗传物质的本质有着重要的作用 在遗传工程的研究中它也是一种重要的工具 噬菌体就它的化学本质来讲 有RNA噬菌体 DNA噬菌体 单链噬菌体 双链噬菌体等 就它和寄主的关系来讲 可以分为烈性噬菌体和温和性噬菌体两大类 5 3 2 1烈性噬菌体20世纪40年代在大肠杆菌T2噬菌体中首次发现了噬菌体的基因重组 T2噬菌体有许多突变型 最早发现的有快速溶菌 r 寄主范围 h 小形噬菌斑 m 等突变型 寄主范围 h 可以感染野生型细菌和抗T2细菌 用B 2表示 h 只能感染野生型大肠杆菌B品系 r为快速溶菌突变型 能产生大噬菌斑 r 为迟缓溶菌 生成小的噬菌斑 当h r 寄主范围正常 但具速溶性状 和hr 无速溶性状 但寄主范围扩大 两种噬菌体同时感染大肠杆菌B品系 然后把子代噬菌体接种在同时长有大肠杆菌B和B 2两种菌组成的混合菌平板上 结果出现四种不同的噬菌斑 图5 17 在四种噬菌斑中 透明而小 hr 和半透明而大 h r 是亲本组合 半透明而小 h r 和透明而大 hr 是重组类型 5 3 2 2温和性噬菌体温和性噬菌体跟F因子一样 宛如附加的细菌基因群 既能以自主的自我复制颗粒存在 也可以插入细菌染色体与其一起复制 噬菌体是最著名的温和性噬菌体 当 侵染大肠杆菌时 发生两种反应 一种是裂解性反应 和烈性噬菌体侵染敏感细菌所进行的反应相同 在寄主体内 侵染的噬菌体DNA立即复制 合成头部和尾部 装配成成熟的噬菌体颗粒 裂解寄主细胞 释放出几百个成熟的噬菌体 另一种是溶源反应 侵染的噬菌体进入寄主细胞后 其DNA可以整合到寄主细胞染色体上 成为细菌染色体的一部分 以原噬菌体形式存在于细胞中 使细菌溶源化 这种状态的温和噬菌体又称为原噬菌体 受 噬菌体侵染的大肠杆菌的裂解只是一小部分 其裂解的确切频率部分依赖于噬菌体和寄主的基因型 部分依赖于侵染的环境条件 其余大部分细菌则进入溶源反应 原噬菌体能够自发的诱变成成熟的噬菌体颗粒而裂解寄主细胞 紫外线是一种有效的诱发因素 在微生物的有性繁殖过程中 不同的性细胞间的接合 并随之发生染色体的重组 从而产生新遗传型后代的现象 称有性杂交 凡是能产生有性孢子的酵母菌和霉菌 都能进行有性杂交 有性杂交在生产实践中被广泛用于优良品种的培育 例如用于酒精发酵的酵母菌和用于面包发酵的酵母菌同属一种啤酒酵母 Saccharomycescerevisiae 的两个不同菌株 面包酵母的特点是对麦芽糖及葡萄糖的发酵力强 产生CO2多 生长快 而酒精酵母的特点是产酒率高而对麦芽糖 葡萄糖的发酵力弱 所以酿酒厂生产酒精后的酵母 不能供面包厂作引子用 通过两者的杂交 就得到了既能生产酒精 又能将其残余菌体用作面包厂和家用发面酵母的优良菌种 5 3 3 1有性杂交 5 3 3真核微生物的基因重组 5 3 3 2准性生殖 是一种类似于有性生殖但比它更为原始的一种生殖方式 是由两个非异配型核的细胞接合后 形成异核体细胞 两核能发生低频率的接合与交换 产生具有新性状的个体 1 菌丝联结发生在一些形态上没有区别的 但在遗传性状上可以有差别的两个同种亲本的体细胞 单倍体 间 2 形成异核体两个单倍体细胞经联结后 使原有的两个单倍体核集中到同一个细胞中 形成双相的异核体 异核体能够独立生活 3 核融合在异核体中的双核融合 产生双倍体杂合子核 核融合后产生杂合子核的频率也是极低的 如构巢曲霉和米曲霉为10 5 10 7 4 体细胞重组和单倍体化双倍体的杂合子极不稳定 在进行有丝分裂时 极少数核中的染色体会发生染色体交换和单倍体化 从而形成极个别具有新遗传性状的单倍体杂合子 5 4微生物的菌种选育菌种选育 就是利用微生物遗传物质变异的特性 采用各种手段 改变菌种的遗传性状 经筛选获得新的适合生产的菌株 以稳定和提高产品质量或得到新的产品 良好的菌种是微生物发酵工业的基础 在应用微生物生产各类食品时 首先是挑选符合生产要求的菌种 其次是根据菌种的遗传特点 改良菌株的生产性能 使产品产量 质量不断提高 如发现菌种的性能下降时 还要设法使它复壮 最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合 这样菌种的优良性能才能充分发挥 5 4微生物的菌种选育 在微生物工业应用中 微生物菌种工作主要包括以下四方面 菌种的分离筛选 挑选符合生产要求的菌种 这是选种工作的任务 菌种培育 改良已有菌种的生产性能 使产品的质和量不断提高 或使它更适应于工艺的要求 这是育种工作的任务 菌种的保藏 一切生产菌种都要使它避免死亡和生产性能的下降 这是菌种保藏工作的任务 退化菌种的复壮 如果发现菌种的生产性能下降 就要设法使它恢复 这便是菌种复壮工作的任务 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 1 1采样以采集土壤为主 也可以从植物腐败物及某些水域中采样 从何处采样 这要根据选菌的目的 微生物的分布状况及菌种的特征与外界环境关系等 进行综合地 具体地分析来决定 由于土壤是微生物生活的 大本营 其中包括各种各样的微生物 但微生物的数量和种类常随土质的不同而不同 一般在有机质较多的肥沃土壤中 微生物的数量最多 中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主 酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多 果园 菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中 酵母和霉菌较多 浅层土比深层土中的微生物多 一般离表层5 15cm深处的微生物数量最多 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 采样应充分考虑采样的季节性和时间因素 以温度适中 雨量不多的秋初为好 采样方式是在选好适当地点后 用无菌刮铲 土样采集器等 采集有代表性的样品盛入清洁的聚乙烯袋 牛皮袋或玻璃瓶中 扎好并标上样本的种类及采集日期 地点以及采集地点的地理 生态参数等 如果我们知道所需菌种的明显特征 则可直接采样 例如分离能利用糖质原料 耐高渗的酵母菌可以采集加工蜜饯 糖果 蜂蜜的环境土壤样本 分离利用石蜡 烷烃 芳香烃的微生物可以从油田中采样 分离啤酒酵母可以直接从酒厂的酒糟中分离等 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 1 2增殖培养一般情况下 采来的样品可以直接进行分离 但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多 就要设法增加所要菌种的数量 以增加分离的机率 增加该菌种的数量 这种人为的方法称为增殖培养 又叫富集培养法 进行增殖培养是根据所分离菌种的培养条件 生理特性来确定特定的增殖条件 其手段是通过选择性培养基控制营养条件 生长条件 加入一定的抑制剂等 其目的是使其他微生物尽量处于抑制状态 要分离的微生物 目的微生物 能正常生长 经过多次增殖后成为优势菌群 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 1 3纯种分离通过增殖培养 虽然目的微生物大量存在 但它不是唯一的 仍有其他微生物与其混杂生长状态 因此还必须分离和纯化 常用的纯种分离方法有稀释分离法 划线分离法和组织分离法 1 稀释分离法将样品进行适当稀释 然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养 待长出独立的单个菌落 进行挑选分离 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 2 划线分离法首先倒培养基平板 然后用接种针 接种环 挑取样品 在平板上划线 划线方法可用分步划线法或一次划线法 无论用哪种方法 基本原则是确保培养出单个菌落 3 组织分离法主要用于食用菌菌种分离 分离时 首先用10 漂白粉或75 酒精对子实体进行表面消毒 用无菌水洗涤数次后 移植到培养皿中的培养基上 于适宜温度培养数天后 可见组织块周围长出菌丝 并向外扩展生长 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 1 3纯种培养分离经过分离培养 在平板上出现很多单个菌落 通过菌落形态观察 选出所需菌落 然后取菌落的一半进行菌种鉴定 对于符合目的菌特性的菌落 可将之转移到试管斜面纯培养 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 1 4筛选从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株 它只是筛选的第一步 所得菌种是否具有生产上的实用价值 能否作为生产菌株 还必须采用与生产相近的培养基和培养条件 通过三角瓶进行小型发酵试验 以求得适合于工业生产用菌种 如果此野生型菌株产量偏低 达不到工业生产的要求 可以留之作为菌种选育的出发菌株 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 1 5毒性试验自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素 为了保证食品的安全性 凡是与食品工业有关的菌种 除啤酒酵母 脆壁酵母 黑曲霉 米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外 其他微生物均需通过两年以上的毒性试验 5 4 1从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 5 4 2 微生物的诱变育种诱变育种是利用物理和化学诱变剂处理微生物细胞群 促进其突变率在同提高 再从中筛选出少数符合育种目的的突变株 诱变育种的主要手段是以合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞 在引起大部分细胞死亡的同时 使存活细胞的突变率迅速提高 再设计既简便 快速又高效的筛选方法 进而淘汰负突变并把正突变中效果最好的优良菌株挑选出来 5 4 2微生物的诱变育种 诱变育种是国内外提高菌种产量 性能的主要手段 诱变育种具有极其重要的意义 当今发酵工业所使用的高产菌株 几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能 其中最突出的例子是青霉素的生产菌种 通过诱变育种 从最初的几百发酵单位提高到目前的几万的发酵单位 诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而且能改进产品的质量 扩大品种和简化生产工序等目的 从方法上讲 它具有方法简便 工作速度快和效果显著等优点 因此 虽然目前在育种方法上 杂交 转化 转导以及基因工程 原生质体融合等方面的研究都在快速地发展 但诱变育种仍为目前比较主要 广泛使用的育种手段 5 4 2 微生物的诱变育种 确定出发菌 菌种的纯化选优 出发菌株性能测定同步培养 制备单细胞 单孢子 悬液 诱变剂选择与诱变剂量的预试验 诱变处理 平板分离 计形态变异菌落数 计算突变率挑选突变菌落纯培养 突变株的初步筛选 重复筛选 摇瓶发酵试验选出突变株进行生产试验 5 4 2 1诱变育种的步骤 5 4 2微生物的诱变育种 1 出发菌株的选择在诱变育种中 出发菌株的选择 会直接影响到最后的诱变效果 具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株 它们对诱变因素敏感 容易发生变异 选取生产中由于自发突变而经筛选得到的菌株 与野生型菌株相类似 容易达到较好的诱变效果 这也是诱变育种常用的方法 选取每次诱变处理都有一定提高的菌株 往往多次诱变可能效果迭加 积累更多的提高 2 同步培养在诱变育种中 处理材料一般采用生理状态一致的单孢子或单细胞 即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态 这称为同步培养 5 4 2 微生物的诱变育种 3 单细胞或单孢子菌悬液的制备在诱变育种中要求待处理的菌悬液呈分散的单细胞或单孢子状态 这样一方面可以均匀地接触诱变剂 另一方面又可避免长出不纯的菌落 菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制 如果是用化学诱变剂处理 因处理时pH值会变化 必须要用缓冲溶液 除此之外 还应注意分散度 方法是先用玻璃珠振荡分散 再用脱脂棉或滤纸过滤 经处理 分散度可达90 以上 供诱变处理较为合适 5 4 2 微生物的诱变育种 4 诱变剂选择与诱变剂量确定首先选择合适的诱变剂 然后确定其使用剂量 常用诱变剂有两大类 物理诱变剂和化学诱变剂 常用的物理诱变剂有紫外线 x射线 射线 等离子 快中子 射线 射线 超声波等 常用的化学诱变剂有碱基类似物 烷化剂 羟胺 吖定类化合物等 物理诱变剂中最常用的有紫外线 由于紫外线不需要特殊贵重设备 只要普通的灭菌紫外灯管即能做到 而且诱变效果也很显著 因此被广泛应用于发酵工业育种 5 4 2微生物的诱变育种 化学诱变剂的种类很多 根据它们对DNA的作用机制 可以分为三大类 第一类是烷化剂 例如硫酸二乙酯 亚硝酸 甲基磺酸乙酯 N 甲基 N 亚硝基胍 亚硝基甲基尿等 第二类是一些碱基类似物 例如5 溴尿嘧啶 5 氨基尿嘌呤 2 氨基嘌呤 8 氮鸟嘌呤等 第三类是吖啶类 决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度 作用温度和作用时间 5 4 2微生物的诱变育种 无论是物理诱变还是化