第四章细胞工程介绍.ppt

第四章细胞工程 第四章细胞工程 教学重点 难点 学时 一 概述二 不同对象的细胞工程 一 微生物细胞工程 二 植物细胞工程 三 动物细胞工程三 细胞工程在环境方面的应用 1 要点细胞工程基础知识 微生物细胞工程 植物细胞工程 动物细胞工程 利用细胞融合技术构建环境工程菌 抗污染型植物2 重点细胞工程的定义 微生物细胞融合 植物组织培养 植物原生质体制备 培养和融合 动物细胞融合 单克隆抗体的制备 细胞拆合 教学要点 重点 学时 一 概述 一 细胞工程相关名词1 细胞是生物体的基本结构单位和功能单位 单细胞生物 一个细胞就是一个个体 而多细胞生物则由许多细胞成一个个体 2 细胞工程 是指在细胞水平上的遗传操作 即通过细胞融合 核质移植 染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法 快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技术 3 细胞融合 是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合的为一个细胞 含有原来两个细胞的染色体 的过程 4 细胞亚结构移植是指将细胞的亚结构 如细胞核 染色体等 移植到另一个细胞中 从而改变细胞的遗传性状 主要有细胞拆合 染色体工程和染色体组工程 5 细胞拆合 即细胞换核技术 是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开 再进行不同细胞间核质的重新组合 重建成新细胞 6 染色体工程 染色体工程是按人们需要来添加或削减一种生物的染色体 或用别的生物的染色体来替换 7 染色体组工程 染色体组工程是整个改变染色体组数的技术 自从1937年秋水仙素用于生物学后 多倍体的工作得到了迅速发展 例如得到四倍体小麦 八倍体小黑麦等 三倍体西瓜是无籽西瓜 但没有后代 一 概述 8 杂交瘤细胞 现代免疫学早已查明 一种抗体是由一种B淋巴细胞产生的 人体内约有一亿种不同的B淋巴细胞 可产生一亿种不同的抗体 依据这种事实 1975年 著名免疫学家米尔斯坦和同事勒尔在英国剑桥大学分子实验室内巧妙地把B淋巴细胞和能无限生长的骨髓细胞合并成一个杂交瘤细胞 杂交瘤细胞因而具备了双重特性 既能无限生长 又能产生B淋巴细胞的抗体 9 单克隆抗体 被人们誉为对付癌症的 生物导弹 如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养 就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群 即单克隆 单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体 称为单克隆抗体 一 概述 10 干细胞是一种具有多项分化潜能和自我复制能力的原始未分化细胞 是形成哺乳类各种组织器官的祖宗细胞 根据来源和个体发育过程中先后次序不同 干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞 组织干细胞 11 虚拟细胞 是一个模拟的细胞 从短期来说 虚拟细胞可用于设计新的药物和治疗方法 人们可以利用模拟技术测试不同的治疗方法 以发现最佳方案 并研究每种方案可能产生的副反应 从长期来说 虚拟细胞可被用于设计更好的生物学系统 甚至创造全新的系统 另外 模拟技术还可用于测试不同的变异 以找出表现最好的那些生物性状 一 概述 12 愈伤组织 是指植物组织地离体状态下 给以一定条件 使已经分化并停止生长的细胞重新分裂生长而形成的没有组织结构的细胞团 13 细胞学说 一切动物和植物都是细胞的集合体 细胞是生命的基本单位 动物和植物都是在细胞的繁殖和分化中发育起来的 这一认识被称为细胞学说 14 植物细胞全能假说 植物体的每一个细胞 包括体细胞 都具有发育成整个个体的潜能 一 概述 二 细胞工程的分类1 按研究对象中需要改造的遗传物质不同 将细胞工程分为基因工程 geneengineering 染色体工程 chromosomeengineering 染色体组工程 genomeengineering 细胞质工程 cytoplasmengineering 和细胞融合等五个方面 这个范围相当广泛 几乎包括了所有的细胞操作和遗传操作 2 细胞工程按其对象不同 也可分为微生物细胞工程 植物细胞工程和动物细胞工程 本章将主要介绍动物细胞工程 一 概述 三 细胞1 细胞的大小与形态 一 概述 各类细胞大小的比较 一 概述 体内最大的细胞体内最大的细胞有各种说法 1 按细胞直径而言 要数卵细胞 其直径约200微米 1微米 1 1000毫米 2 以细胞长度来说 当之为骨骼肌细胞 长的可超过4厘米 3 而以细胞突出的长度来划分 当之无愧的是神经细胞 也称神经元 神经元的轴突长的可达1米以上 故神经元可称之为体内最大的细胞了 它们的活动受机体神经体液因素的调节 线粒体最多的细胞 人体内线粒体最多的细胞是肝脏的肝细胞 每一个肝细胞内约有2000个线粒体 溶酶体最多的细胞 最多要数巨噬细胞 溶酶体内含有50多种水解酶 内质网最多的细胞 浆细胞是含有内质网最多的细胞 浆细胞是由B淋巴细胞在抗原刺激下分化增生而来的 是一种不再具有增殖分化能力的终末细胞 寿命最长的细胞 神经细胞的寿命最长 细胞形态的多样性 酵母菌 植物纤维细胞 植物表皮细胞 动物精子 一 概述 2 细胞的结构无论各种细胞的大小和形态有多大的差异 它们都由一层具有一定生物学功能的细胞膜包裹在细胞外层 根据细胞的内部结构 可将生物界的细胞分为两大类 原核细胞和真核细胞细菌 蓝藻和放线菌等由原核细胞构成的有机体称为原核生物 几乎所有的原核生物都由单个原核细胞构成 而由真核细胞构成的有机体则称为真核生物 1 原核细胞的形态结构基本特点 A 主染色体为一个环状裸露DNAB 无核膜C 无膜系构造细胞器D 以无丝分裂繁殖主要代表 细菌 蓝藻等 一 概述 纤毛 细胞壁 拟核 鞭毛 核糖体 质膜 内含物 细菌结构模式图 一 概述 2 真核细胞的形态结构三大结构体系 生物膜系统质膜 内膜系统 细胞器 遗传信息表达系统染色质 体 核糖体 mRNA tRNA等细胞骨架系统胞质骨架 核骨架 一 概述 微丝 叶绿体 线粒体 质膜 液泡 细胞核 内质网 微管 细胞壁 高尔基体 植物细胞模式图 动物细胞模式图 微丝 微管 质膜 线粒体 中心体 细胞核 溶酶体 内质网 高尔基体 1 无丝分裂 无纺锤丝出现 染色体 DNA 复制后直接移到两个仔细胞中 2 细胞增殖周期 有丝分裂 G0期 休眠期G1期 DNA合成前期S期 DNA合成期G2期 DNA合成后期M期 有丝分裂期 3 细胞的分裂和分化 细胞分裂间期 有丝分裂期 前期 中期 后期 末期 子细胞 分为G1期 S期和G2期三个阶段 新生细胞的去向 重新进入细胞周期 细胞分化成为Go期细胞 3 细胞分化多细胞生物体是由各种各样形态和功能都不同的细胞群所组成 高等动 植物由受精卵细胞开始的胚胎发生过程随着细胞分裂次数的增加而使得早期胚胎的细胞数量也增加许多 其中有些细胞在形态 结构和功能上逐渐发生了差异 这种细胞之间差异的发生过程就是细胞分化 个体发育的过程就是细胞分化的过程 个体的各种器官和组织都是通过细胞分化形成的 一 概述 4 癌细胞 癌细胞的主要特征 1 脱分化 已分化细胞失去分化后的特性 恢复分裂增殖能力 2 无限增殖3 失去接触抑制现象4 细胞表面和粘附性质改变5 细胞骨架紊乱6 对生长因子需求降低 一 概述 二 不同对象的细胞工程 一 微生物细胞工程1 定义 微生物细胞工程应用微生物进行细胞水平的研究与生产 具体内容包括各种微生物细胞的培养 遗传性状的改造 微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等 2 细胞融合基本过程原生质体的制备 融合重组 原生质体再生成细胞 融合重组的测定 1 原生质体的制备酶解法质生质体的形成率 原生质体数 未经酶处理的总菌数 革兰氏阳性菌 溶菌酶 肽聚糖中N 乙酰胞壁酸与N 乙酰葡萄糖胺之间的 1 4 糖苷键 革兰氏阴性菌 溶菌酶 数分钟后 0 1mol L的EDTA共同作用15 20min 则可使90 以上的革兰氏阴性菌转变为可供细胞融合用的球状体 真核细胞 消解酶 蜗牛酶 纤维素酶 几丁质酶等处理 原生质体得率在90 以上 二 不同对象的细胞工程 注意 原生质体制备后必须用渗透压稳定剂维持其稳定性 2 融合重组p146图4 6注意 原生质体融合重组作为基因声称的一种有效方法 需经历三个主要阶段 细胞融合形成异核体 不同核融合产生二倍体 融合核交换和重组生成重组体 3 原生质体再生成细胞 二 不同对象的细胞工程 置于高渗再手固体培养基中 再生频率 原生质体再生细胞数 总菌落数 100 主要是利用原生质体对渗透压的敏感性 4 融合重组的测定 直接法 不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物 间接法 亲株和重组子都再生 然后用影印法复制到选择培养基上以检出重组子 融合频率 融合子数 再生的原生质体数 二 不同对象的细胞工程 二 不同对象的细胞工程 二 植物细胞工程1 定义 以植物细胞为基本单位在体外条件下进行培养 繁殖和人为操作 改变细胞的某些生物学特性 从而改良品种加速繁育植物个体或获得有用物质的技术 2 植物组织培养 1 植物组织培养 是一种将植物组织 器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养 并重新再生细胞或植株的技术 包括植物培养 胚胎培养 器官培养 悬浮培养 植物组织培养 二 不同对象的细胞工程 2 进行植物组织培养 一般要经历以下五个阶段 a外植体的选择及培养 b诱导去分化阶段 c继代增殖阶段 d诱导分化生根成芽阶段 e移栽成活阶段 3 植物细胞培养 二 不同对象的细胞工程 单个细胞 营养培养基 克隆植株 工业化植物细胞培养系统主要有两大类 悬浮细胞培养系统和固定化细胞培养系统 4 植物细胞杂交 1960年英国诺丁汉大学Cocking教授领导的小组率先利用真菌纤维素酶 成功地制备出了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体 开辟了原生质体融合研究的新阶段 植物细胞杂交的主要过程如下 1 原生质体的制备 机械法与酶法 2 原生质体的融合 物理方法与化学法 膜融合与核融合 二 不同对象的细胞工程 3 杂合体的鉴别与筛选 显微镜 互补法 细胞与分子生物学法注 原生质体培养过程 脱去细胞壁的原生质体 细胞壁再生 细胞分裂形成细胞团 愈伤组织 分化形成芽和根 完整植株 二 不同对象的细胞工程 细胞育种诱导突变 筛选新品系 新品种 次生代谢产物生成从培养的植物细胞中提取所需的代谢产物 优点 比栽培原料作物更易控制最佳生产条件 培养物为无菌 无虫材料 能保证产品质量 工艺操作较为简单 可减少劳动费用 提高生产率 5 植物细胞工程的应用 植物细胞工程的实际应用 江苏省宜兴中学赵家飞 探究 1 回忆植物组织培养技术的基本原理和过程 2 思考利用这项技术能做哪些工作 植物繁殖的新途径 微型繁殖技术 概念 是快速高效实现种苗繁植培育优良植物品种的植物组织培养技术 优点 繁殖速度快 高保真 因为是无性繁殖 不受自然生长季节的限制 因为在具有一定人工设施的室内生产 1 人们利用植物的微型繁殖技术来进行工厂化育苗生产 这是利用了该项技术的哪些特点 提示 植物 微型 繁殖技术具有高效性和可以保持种苗的优良遗传特性的优势 工厂化大规模育苗生产正是利用了植物 微型 繁殖技术的这两方面优势 利用植物 微型 繁殖技术我们可以在短时间中获得大量的优质种苗 2 作物脱毒 作物脱毒的原因 长期进行无性繁殖的作物 易积累感染的病毒 导致产量降低 品质变差 而植物的分生区一般不会感染病毒 用分生区的细胞进行组织培养 就能得到大量的脱毒苗 作物脱毒材料 作物脱毒方法 结果 分生区 如茎尖 的细胞 进行组织培养 脱毒苗 3 人工种子 概念 产生途径 为什么要造人工种子 天然种子的缺陷有哪些 探究 通过植物组织培养得到的胚状体 不定芽 顶芽和腋芽等为材料 经过人工薄膜包装得到的种子 在适宜的条件下可以发芽成苗 1 由已脱分化的外植体直接产生 2 由愈伤组织产生 探究 人工种子具有哪些优点 1 不受季节的限制 2 可以很方便的储藏和运输 3 不会造成遗传性状的改变 作物新品种的培育 1 传统方法 原理 基因的自由组合定律 优良基因的自由组合 杂交育种 结果 通过基因重组 把两亲本的优良性状组合在同一后代中缺点 要不断进行 多年 纯化和选择 才得到一种符合理想要求的新品种 单倍体育种 1 单倍体的概念 2 单倍体的例子 由配子发育成的个体 蜜蜂中的雄蜂是由未受精的卵发育来的单倍体 多数植物都可通过花药或花粉来获得单倍体 花药离体培养过程 2 突变体的利用 突变体产生 植物组织培养突变体的利用 筛选对人有利的突变体培育新品种 3 细胞产物的工厂化生产 1 种类 2 利用的枝术 组织培养3 过程 案例 紫杉醇 Paclitaxel 是继阿霉素和铂类抗癌药之后本世纪后期最受人们重视的一种抗癌新药 是一新发现的有丝分裂抑制剂 其作用机理在于阻止微管正常生理聚集 抑制癌细胞的有丝分裂和纺锤体的形成 从而使癌细胞的复制受到阻断而凋亡 1967年美国化学家Wall和Wani等首先从太平洋紫杉 短叶红豆杉 Taxus brevifolia 树皮中提取出来 该药于1990年进入 期临床试验 1992年底获美国FDA批准上市 紫杉醇存在于红豆杉属植物的树皮 叶及茎中 其中树皮中的含量最高 大约从12000株成年紫杉树中才能提取1KG的紫杉醇 而且紫杉的生长周期很长 在世界分布很少 紫杉醇的国际市场价格为450美元 g Ketchum从6种紫杉醇属植物中进行愈伤组织的诱导 获得了产生紫杉醇的高产细胞株 在悬浮培养下 细胞内的紫杉醇含量超过了20mg L 清华大学化工系生物化工研究所通过固液两步培养法可以在4周内获得20g L干物质 利用代谢调控技术在2 3天内将紫杉醇的含量提高到0 063 左右 紫草宁可用作创伤 烧伤以及痔疮的治疗药物 同时又因为其漂亮的紫红色而作为高级色素使用 紫草宁产生于亚洲的多年生植物紫草的根部 但紫草资源严重不足 在日本 紫草已濒临灭绝 在我国 紫草 Arnebiaeuchroma 列入了国际二级保护植物 利用植物细胞培养生产天然色素典型案例 紫草宁 紫草的人工栽培成活率低 而且直接提取紫草宁的无法满足市场需求 化学合成紫草宁的工艺非常复杂 且最终产率只有0 7 生产成本昂贵 紫草宁在国际市场上售价高达7000美元 kg 1974年Tabata等就研究了用于培养紫草细胞的培养基 11981年Tabata和Fujita等又用大的培养容器进行细胞悬浮培养并获得了紫草宁衍生物 日本在1983年进行紫草细胞大规模培养来生产紫草宁 我国南京大学等从1986年开始对该项目进行研究 在进行大量的研究之后得出 在适当的条件下 培养的紫草细胞悬浮物中紫草宁含量占干重的14 比紫草根中的含量高10倍 转基因植物 一 转基因生物的概念 二 转基因植物的构建方法 三 转基因植物的应用 四 转基因植物的安全性 略 略略略略略 一 转基因生物的概念 转基因生物 将一种生物的基因导入另一种生物 定向改造生物 定向改造生物 使之向着有利于人类需要的方向发展 世界第一例转基因植物 烟草1983年在美国问世 1986年 首批转基因植物 抗虫和抗除草剂棉花进入田间试验 1992年中国成为世界上第一个转基因植物商品化种植的国家 开创了转基因植物商品化应用的先河 当时种植的是一种抗黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒双价转基因烟草 略略略略略 二 转基因植物构建方法 1农杆菌导入法对象 双子叶植物 部分裸子植物和少数单子叶植物 过程 先将带有目的基因的质粒整合到农杆菌基因组中 再将此农杆菌与植物细胞共同培养36 48h 转化植物细胞 然后分离洗涤去菌后通过组织培养获得转基因植物或形成冠瘿瘤和发状根等组织 这些组织也就是一种天然的选择标记 略略略略略 2基因枪法 金属微粒表面附着含有目的基因的DNA分子 经过加速处理 轰击植物细胞 将DNA直接注射入植物细胞 转化率可达8 10 3花粉管通道法 将目的基因整合后 在植株开花时利用花粉管通道直接导入受体植株 4原生质融合法 去细胞壁植物细胞而得原生质体 然后用带有目的基因的载体去转化此原生质体 再通过筛选 得到转基因植物 略略略略略 三 转基因植物的应用 1 转基因植物在农业上的应用转基因植物在农业上的应用就是利用生物技术将某些外源生物的基因转移到农作物中去 改造生物的遗传物质 使其在性状 营养品质 消费品质等方面符合人类所需要的方向转变 如果以转基因植物得到的产品为直接食品或原料加工生产的食品就是转基因食品 略略略略略 对于农作物本身 目前直接提高产量还比较困难 主要是构建那些具有抗病 抗虫 抗病毒和抗除莠剂能力的转基因植物 因为抗性都是有单个基因所控制的 另外 还可改变农产品的质量 比如提高蛋白质中必需氨基酸含量 改变油脂的组成 延长果品的保险期等 略略略略略 1 抗除草剂基因工程 将具有除草作用的酶和蛋白质转进植物 使其拷贝大大增加以除草剂为底物的酶的基因转移到植物中利用基因突变技术使除草剂识别和作用特定位点的氨基酸基因位点突变2 抗虫基因工程 根据抗虫基因的来源 可从细菌中 植物组织中和动物体内分离出相关抗性基因 再转入植物中去 3 抗逆基因工程 包括抗旱 抗寒 抗热和抗盐等方面 略略略略略 2 转基因植物生产药用蛋白质 利用转基因植物作为生物反应器生产疫苗 如乙型肝炎表面抗原转基因植物优点 1 易形成产业化规模 2 价格便宜 3 安全 4 使用方面不足之处 转基因植物中重组蛋白含量低植物外源蛋白的提取和纯化还没有达到产业化水平 还停留在实验室水平 略略略略略 四 转基因植物的安全性 从理论上讲 转基因技术和常规杂交育种都是通过优良基因重组获得新品种的 但常规育种是模拟自然现象进行的 基因重组和交流的范围仅限于种内近缘种间 而转基因技术则可以把任何生物甚至是人工合成的基因转入植物中 人们无法预测将基因转入一个新的遗传背景中会是何种结果 故而产生很多疑虑 主要是关注其食品安全性和生态安全 略略略略略 1 食品安全性安全问题转基因食品中的外源基因对人体有无毒性转基因植物食品中的外源基因是否发生转移转基因植物中外源基因编码蛋白对人体是否有害转基因植物食品中的抗生素标记基因编码蛋白是否会使食用者产生抗生素抗药性转基因植物中外源基因的次生效应问题 略略略略略 2 生态安全性问题转基因植物是否会演变成农田杂草基因漂流到近源野生种的可能性昆虫抗药性的产生 略略略略略 二 不同对象的细胞工程 三 动物细胞工程1 定义 以动物细胞为基本单位在体外条件下进行培养 繁殖和人为操作 使细胞产生某些人们所需要的生物学特性 从而改良品质 加速繁殖动物个体或获得有用品系的技术 2 动物组织培养 是指将取自动物的某类组织 在体外培养并一直保持原本已分化的特性 该组织的结构与功能持续不发生明显变化 3 细胞培养 是指离体细胞在无菌培养条件下的分裂 生长 在整个培养过程中细胞不出现分化 不再形成组织 可分悬浮型和贴附型 4 动物细胞杂交 1 融合方法 病毒诱导融合 化学诱导融合 电激诱导融合 二 不同对象的细胞工程 2 筛选形成五种类型的细胞 异型融合细胞 双核 多核 两种同型融合细胞 双核 多核 未发生融合的两种亲本细胞 筛选原理 后四种不成活 多核融合细胞因核分裂受阻而死亡 a HAT选择系统 二 不同对象的细胞工程 b 抗药性选择系统c 营养缺陷型选择系统5 克隆 1 定义 两种说法 克隆是指离体条件下的无性繁殖 2 克隆 多莉 二 不同对象的细胞工程 3 克隆意义 a遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物 人 生长 发育 衰老和健康等机理的研究 b有利于大量培养品质优良的家畜 c经转基因的克隆哺乳动物 将能为人类提供源源不断的廉价的药品 保健品以及较易被人体接受的移植器官 d科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆 即借腹怀胎的新领域 这无疑将大大促进对濒临灭种的哺乳动物的保护工作 二 不同对象的细胞工程 多莉 克隆猴 6 抗体 1 结构与功能p162 p163注意 Fc Fab Fv表达的含义与区别Fab Fv 有抗原结合活性与特异性Fc 无抗原结合活性 但它是抗体结合抗原后激活机体免疫反应的主要部位 二 不同对象的细胞工程 7 干细胞工程 体内干细胞的意义在于源源不断地补充体内一些短命组织的细胞来源 如血液细胞 皮肤细胞以及精巢等 或者组织或器官受到局部损伤时 它们可以再分裂形成新的该组织和器官 是体内的一种自我修复机制 人体干细胞基本分为三种类型 全能干细胞 多能干细胞和专能干细胞 人类干细胞工程就是利用人体内干细胞的特征来达到体外产生人类所需的产物的探索 二 不同对象的细胞工程 干细胞分化模式 胚胎干细胞 embryostemcell 具有分化成多种细胞类型及构建组织的潜能 造血干细胞 单能干细胞 monopotentialcell 三 用途1 构建环境工程菌2 抗污染型植物3 开发基于抗体的技术治理环境污染 二 不同对象的细胞工程 四 常用的技术手段 包括动物细胞培养 动物细胞融合 单克隆抗体 胚胎移植 核移植等 动物细胞培养是其他细胞工程技术的基础 一 动物细胞培养1 培养液 液体培养基 葡萄糖 氨基酸 无机盐 维生素 动物血清等 2 过程 动物胚胎或胰蛋白酶制成幼龄动物的剪碎单个细胞加培养液器官 组织细胞悬浮液细胞株细胞系 原代培养传代培养 遗传物质改变传代培养 原代培养 将组织取出来后 先用胰蛋白酶等处理使组织分散成单个细胞 然后配制成一定浓度的细胞悬浮液 再将悬浮液放入培养瓶中 这个过程称为原代培养 第1代 第10代以内 传代培养 把原代培养增殖的细胞定期用胰蛋白酶把细胞从瓶壁上脱离出来 配制悬浮液 分装到两个或两个以上的培养瓶中培养 这称为传代培养 细胞株 原代细胞和50代前的传代细胞叫做细胞株 细胞系 50代后 遗传物质发生了改变 并且有癌变的特点 无限传下去的传代细胞 细