兽疫链球菌生产透明质酸的生理学原理和应用

研究生课程 微生物生理学学习报告 题目 兽疫链球菌生产透明质酸的生理学原理和应用 姓名 任小虎 1 透明质酸的研究背景透明质酸的研究背景 1 1 透明质酸的结构与性质透明质酸的结构与性质 透明质酸 Hyaluronic acid 简称HA 是一种线性酸性粘多糖 是糖胺聚糖中 结构中最简单的一种 化学名称为糖醛 玻璃 酸 分子式为 C14H20NNaO11 n 分子质量为10 200万道尔顿 Rapport 1 等在上世纪五十年代对HA结构的测定 做了大量的工作 他们认为HA是由等摩尔的葡糖醛酸和乙酰氨基葡糖组成的 Brimacombe 2 对酶降解氨基葡萄甘酸键所得的低聚糖进行结构分析研究 也获得一致结论 即确认HA是由D 葡萄糖醛酸和N 乙酰氨基葡萄糖单体为结构 单元 3 通过 1 4糖苷键反复交替连接而组成的线形多糖结构 其一级和二级 结构分别如图1 4 图2 5 所示 图 1 透明质酸的一级结构 图 2 透明质酸的螺旋型二级结构 HA通常溶于水 不溶于醇 酮 乙醚等有机溶剂 水溶液中的HA分子可 产生分子内和分子间的相互作用 具有特殊的理化性质 具体表现为 零切变 粘度 假塑性 粘弹性 易降解性 可发生交联反应 酯化和成盐反应等特性 其中 商品HA为HA Na盐形式 即HA Na 简称SH 外观为白色纤维状或粉 末状固体 具有很强的吸湿性 1 2 透明质酸的研究意义透明质酸的研究意义 HA 及其盐广泛分布于机体的各种组织中 具有特殊的生理功能 具体表 现为 保水作用 润滑作用 对细胞的保护作用 对组织和血管生成的作用 对肿瘤的防治作用 对创伤愈合和止血等方面的作用 由于这些生理功能 HA 被广泛应用于日化用品 食品保健 美容整形及医药等领域 1 2 1 HA 在化妆品级领域的应用在化妆品级领域的应用 HA 具有保湿 营养 润肤等作用 广泛用于各种高级化妆品中 与传统 的保湿剂相比 HA 具有更高的保湿效果 而且没有油腻和阻塞皮肤等缺点 HA 于皮肤的表皮和真皮中均分布存在 真皮中的 HA 含量一般多于表皮 HA 在皮肤组织中的作用主要是 具优良的保水功能 维持细胞外的空间 大离子 功能 参与角蛋白细胞的变化过程 受体结合作用以及清除自由基等功能 1 2 2 HA 在食品保健领域的应用在食品保健领域的应用 上世纪八十年代末 在日本出现了口服 HA 美容保健食品 它的基本的理 论依据是 HA 经口服消化吸收 作为体内 HA 合成的前体物质 增加 HA 在皮 肤和其它组织中的合成量 从而增加皮肤的保水性能 使之更富有弹性 减少 皱纹 在人体内 HA 的量减少会引起胶原蛋白的变化 胶原蛋白的变化继而引 起皮肤的变化 所以 要防止皮肤过早老化 或者当皮肤已经出现老化现象 通过补充 HA 的方式可以维持胶原蛋白的功能 即 HA 可起到延迟皮肤衰老的 作用 1 2 3 HA 在医药领域的应用在医药领域的应用 HA 在医药领域具有广泛的应用 其中 HA 在药物中可以作为载体 在临 床上的应用主要表现为 HA 在眼科中的应用 HA 在关节疾病治疗中的应用 HA 在外科手术中的应用 以及 HA 在疾病诊断中的应用等 单纯的 HA 制剂在临床应用中主要有 3 种类型 胶体涂布 液体喷雾和薄 膜覆盖 可广泛应用眼科 骨科 耳科 风湿性痛疼 关节炎等的治疗 均已 经取得了令人满意的成果 临床上通过检测 HA 的血清含量水平 反映各种疾 病的变化 现在 HA 凝胶已作为必需的填充剂广泛应用于人工晶体植入术 白 内障囊外摘除术 角膜移植术以及视网膜剥离术等多项有关眼科手术 另外 HA 还可以在干眼症和泪道再通等方面发挥作用 HA 还可用于关节的注射治疗 并具备较好的疗效 无副作用 是治愈干性鼓膜小穿孔的良好选择之一 2 透明质酸的生产透明质酸的生产概况概况 2 1 透明质酸的生产方式透明质酸的生产方式 HA 目前在工业上生产方式主要有两大类 一是从动物组织中提取 二是 利用细菌发酵法 近年来 也出现了实验室人工合成的 HA 但合成成本高 技术尚不成熟 目前暂不具备工业生产的条件 2 2 1 组织提取法组织提取法 组织提取法制备 HA 制备过程包括提取 除杂 沉淀 和分级分离等过 程 根据不同的组织 HA 提取纯化过程有一定的差别 玻璃体和润滑液 HA 以溶解形式出现 我国已经成功从羊眼 鸡冠 兔皮等动物材料中分离出 HA 并应用于眼科及外科 化妆等 以鸡冠为原料提取 HA 及以动物眼玻璃体为原 料制备制备透明质酸技术已经非常成熟 HA 在动物组织中的分布较为广泛 几乎所有的动物组织都含有 HA 只是 含量多少而已 人尿和人血清等中都能分离提取出 HA 但考虑到原料来源难 易及成本等因素 通常用于组织提取法生产 HA 的原料主要为鸡冠 动物眼球 以及人脐带等 提取方法比较类似 均是利用有机溶剂提取分离 HA 2 2 2 微生物发酵法微生物发酵法 生产 HA 的菌种主要是链球菌 例如马疫链球菌 兽疫链球菌和类马链球 菌等 除链球菌外 还有 Pasteurella multocida 也可以产生 HA 6 生物发酵法生产 HA 较组织提取法具有很多优势 具体为 HA 产量不 受动物等原料资源限制 且品质可控 HA 在发酵液中游离存在 易于分离 纯化 易于规模化生产 可通过发酵培养参数条件进行控制 提高 HA 的分 子量 生产成本低 发酵法生产 HA 的主要工艺过程为摇瓶种子液的培养 种子罐种子液的培 养 发酵 下游分离纯化 过滤 醇沉淀 HA CPC 沉淀 脱水干燥等 等过 程 最后经旋转式真空干燥获得 HA 2 2 3 人工合成法人工合成法 近年 日本京都大学科学家人工合成出了 HA 采用人工合成法可大大减 少 HA 的生产成本 人工合成的 HA 与天然 HA 品质相近 7 人工合成 HA 的方 法为 先使用多糖类聚合物合成 HA 氧氮杂环戊烯衍生物 然后再添加分 解酶 羊或牛的精巢性 HA 酶 制备出酶和衍生物的复合体 最后清除反应液 中的酶 经沉淀 分离和精制可成 HA 但目前在国内该技术还没发展起来 现阶段主要还是以发酵法生产 HA 为主 组织提取法生产为辅 2 2 HA 的微生物合成途径的微生物合成途径 经过多年的研究 可以确定 HA 的合成需经过如图 3 所示途径 合成 HA 的两个前体是葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖 葡萄糖激酶将葡萄糖转化成 6 P 葡萄糖 其有三条代谢途径 进入戊糖磷酸途径 在磷酸葡萄糖变位酶 EC 5 4 2 2 的作用下转化成 1 P 葡萄糖 或在磷酸葡糖异构酶的作用下转化成果糖 1 P 葡萄糖在 UDP 葡萄糖焦磷酸化酶 HasC EC 2 7 7 9 的作用下转化成 UDP 葡 萄糖 UDP 葡萄糖在 UDP 葡萄糖脱氢酶 HasB EC 1 1 1 22 的作用下转化成 UDP 葡萄糖醛酸 果糖有两条代谢途径 进入糖酵解途径或者在转酰胺酶 EC 2 6 1 16 的作用下转化成 6 P 氨基葡萄糖 6 P 氨基葡萄糖在转乙酰基酶 EC 2 3 1 4 的作用下转化成 6 P N 乙酰氨基葡萄糖 其在变构酶 EC5 4 2 3 的作用 下转化成 1 P N 乙酰氨基葡萄糖 1 P N 乙酰氨基葡萄糖在焦磷酸化酶 EC 2 7 7 23 的作用下转化成 UDP N 乙酰氨基葡萄糖 UDP 葡萄糖醛酸和 UDP N 乙酰氨基葡萄糖在 HA 合成酶 HasA 的作用下合成 HA 8 从图 3 不难看出 一些用于 HA 合成的前体如 1 P 葡萄糖 UDP 葡萄糖和 UDP N 乙酰氨基葡萄糖胺同时也用于合成细胞壁 约占细胞干重的 20 w w 即 HA 合成和细胞生长之间存在着对碳源的竞争性关系 这是兽疫链球菌发酵 生产 HA 的一个很重要的代谢特性 同时部分碳源 果糖 进入糖酵解途径 产能 途径 其主要代谢产物为乳酸 乳酸对细胞生长和 HA 合成有较强的抑制作用 因此如何有效转变细胞的产能途径以降低乳酸对细胞生长和 HA 合成的抑制作 用对于提高整个发酵过程的生产强度和生产效率具有重要的意义 图 3 HA 的生物合成途径 2 3 微生物发酵法生产微生物发酵法生产 HA 研究中仍存在的问题研究中仍存在的问题 如上所述 HA 的生理功能已被人们所认识 具有的广阔应用前景已逐渐 展现在人们眼前 而作为一种商品 HA 的质量和成本正成为制约 HA 广泛应 用的一个重要因素 发酵法生产 HA 的成功是近年来 HA 生产研究取得的最重 大的进展 由于其所具有的优点 已逐渐取代传统的动物组织提取法进行 HA 生产 但是近年来原材料价格的上涨和相应生产成本的提高对 HA 的微生物发酵 法生产构成了巨大挑战 进而限制了其在医药 化妆品和食品保健领域的广泛 应用 因此如何进一步提高微生物发酵法生产 HA 的产率 产量和生产强度成 为了推动 HA 产业持续发展的关键问题 由于发酵过程的高粘度特性以及生产 菌株兽疫链球菌 S zooepidemicus 自身的生理代谢特性 使得 HA 产量和产率的 提高受到多方面因素的制约 主要有 1 兽疫链球菌 S zooepidemicus 是一种营养要求苛刻的微生物 需提供许 多生长必需物质才能正常生长 核苷酸是菌体合成细胞遗传物质的重要组分 是菌体生长的必要物质 HA 两种前体物质尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖醛酸 UDP GlcA 和尿嘧啶核苷二磷酸 N 乙酰氨基 葡萄糖 UDP GlcNAc 中均含有尿嘧啶核 苷二磷酸 UDP UDP 循环参与了 HA 的合成 而 S zooepidemicus 不能完全由 自身合成核苷酸 所以只有保证充足的核苷酸 细胞才能进行正常的生长代谢 HA 才能正常合成 此外 由于多种氨基酸的缺陷 外源氨基酸必须均衡全面 这样细胞才能顺利地生长 各种酶系才能良好发育 在消除细胞和 HA 合成的 限制性因素后 有可能使代谢网络通量按照有利 HA 合成的最优方式或接近最 优方式进行 这就需要对发酵过程中的氨基酸和核苷酸的代谢动力学进行深入 研究 找到细胞生长和 HA 合成的关键氨基酸和核苷酸并进行代谢调控和优化 提高 HA 的产量 产率和生产强度 2 细胞生长和 HA 合成之间存在着对碳源和能量的竞争关系 用于 HA 合成 的一些前体物质同时也用于菌体细胞壁的合成 如 HA 合成途径中的乙酰氨基 葡萄糖 1 P 葡萄糖 UDP 葡萄糖也同时用于微生物细胞壁的合成 9 因此在 碳源的代谢速率不受到影响的条件下 抑制细胞生长有利于 HA 的合成 3 透明质酸发酵优化研究透明质酸发酵优化研究 细胞生长对 HA 的合成有较大影响 这种影响主要是由细胞生长和 HA 合 成之间存在的对碳源和能量的竞争关系引起的 因此 若能够降低细胞生长和 HA 合成之间对碳源的竞争 提高碳源对 HA 的转化率 就有可能提高 HA 产量 降低这种对碳源竞争关系的一种有效途径就是提供给微生物充足生长必需物质 自身合成或外源提供 S zooepidemicus 是一种营养要求苛刻的微生物 需提供 许多生长必需物质才能正常生长 S zooepidemicus 是多种氨基酸缺陷型的生产 菌株 必须提供均衡 全面的氨基酸 细胞才能顺利生长 各种酶系才能良好 的发育 才有可能使代谢网络通量按照有利 HA 合成的最优方式或接近最优方 式进行 此外 核苷酸是菌体合成细胞遗传物质的重要组分 是菌体生长的必要物 质 HA 的两种前体物质尿嘧啶核苷二磷酸葡萄糖醛酸 UDP GlcA 和尿嘧啶核 苷二磷酸 N 乙酰氨基 葡萄糖 UDP GlcNAc 中均含有尿嘧啶核苷二磷酸 UDP UDP 循环参与了 HA 的合成 而 S zooepidemicus 不能完全由自身合成核苷酸 所以只有保证充足的核苷酸 细胞才能进行正常的生长代谢 HA 才能正常合 成 3 1 材料与方法材料与方法 3 1 1 菌株菌株 兽疫链球菌 Streptococcus zooepidemicus WSH 24 3 1 2 培养基培养基 斜面培养基 g L 心脑浸粉 BHI 37 葡萄糖 10 酵母粉 10 琼脂粉 20 pH 7 2 种子培养基 g L 蔗糖 20 酵母粉 20 七水硫酸镁 2 0 四水硫酸锰 0 1 磷酸二氢钾 2 0 碳酸钙 20 微量元素 1mL L 缓冲液 40 mL L pH 7 2 微量元素 g L 氯化钙 2 0 氯化锌 0 046 五水硫酸铜 0 019 缓冲液 g L 磷酸氢二钠 36 76 磷酸二氢钠 15 98 碳酸氢钠 12 5 发酵培养基 g L 酵母粉 20 磷酸氢二钠 6 2 硫酸钾 1 3 蔗糖 70 七水 硫酸镁 2 0 微量元素 1mL L pH 7 2 3 1 3 培养方法培养方法 斜面培养 接种后的斜面置于 37 恒温培养箱中培养 16 h 用于摇瓶接种 种子培养 将培养好的斜面种子接种至装有 50 mL 种子培养基的 500 mL 三角瓶中培养 摇床转速 200 r min 温度 37 培养时间 14 16 h 发酵培养 按 10 的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐 KFT 7 L 罐 中装发酵培养基 3 5 L 搅拌转速 200 r min 通气量 1 0 vvm 温度 37 pH 采用 pH 电极进行在线检测 通过自动加料泵流加 5 mol L NaOH 溶液进行调节 以维持 pH 变化在 7 0 0 1 以内 溶氧电极在线检测溶氧浓度 每隔 2 h 取样一 次进行检测分析 3 1 4 分析方法分析方法 取 5mL 培养液 加入约 2 倍体积的乙醇 然后在 5000 r min 下离心 15 min 上层清夜收集后作进一步分析 测定乳酸 残糖 沉淀经蒸馏水洗涤两次 后溶于水中测定透明质酸含量 透明质酸含量测定 采用 Bitter Muir 氏法 10 乳酸测定 乳酸由 SBA 40C 生物传感分析仪测定 细胞浓度测定 取 25 mL 发酵液 经 3000 r min 下离心后再用蒸馏水洗涤 2 次 得到的湿细胞在 105oC 下烘至恒重 计算出细胞干重 dry cell weight DCW 在 660nm 下 使用分光光度计 722s 分光光度计 上海 测定发 酵液的吸光度 建立吸光度与细胞干重的关系式 通过测定发酵液的吸光度计 算细胞浓度 氨基酸测定 取 5 mL 发酵液用 10g 100mL 的三氯乙酸等体积稀释 放置 1h 用双层滤纸过滤 取滤液 1mL 于 1 5 mL 离心管中 10000 r min 离心 10 min 用移液器取 200 uL 进样分析 色谱条件 柱温 40 流速 1 0 mL min 紫外检测器 338nm 262 nm 3 2 HA 发酵过程中氨基酸代谢动力学发酵过程中氨基酸代谢动力学 微生物生长约需 20 种氨基酸 对于有多种氨基酸缺陷的 S zooepidemicus 来说 其生长和代谢需要供给各种氨基酸 若供给均衡 消除少部分氨基酸的 限制 减轻过量氨基酸的抑制 可以促进细胞生长和 HA 合成 对发酵过程中 18 种常见游离氨基酸的代谢动力学进行考察 以确定各种氨基酸的利用情况 3 3 添加核苷酸碱基对添加核苷酸碱基对 HA 发酵过程的影响发酵过程的影响 在确定了对细胞生长有重要影响的三种关键氨基酸并对其添加浓度进行优 化之后 又考察了核苷酸碱基 腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 尿嘧啶 的添加对 HA 发酵的影响 参考文献参考文献 1 Rapport MM Weissman B Linker A et al Isolation of a crystalline disaccharide hyalobiurou ronic acid form hyaluronic acid J Nature 1951 168 996 997 2 Brimacombe Carbohydrate chemistry M volume 7 1975 3 Raport MM Wessman B Linker A er al Isolation