酶免疫技术

酶免疫技术,第一节 酶免疫技术的特点,基本原理：Ab+E Ab-E+Ag AgAb-E+底物 显色 Ag+E Ag-E+Ab AgAb-E+底物 显色 该实验利用了酶催化底物的生物放大作用，可对标本中抗原（抗体）进行定性、定位和定量分析。,相结合的技术,酶标记免疫技术又称酶免疫技术：,抗原抗体反应的特异性 酶促反应的专一性,应用评价：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染，不需特殊设备。易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点:免疫学活性不变;酶对底物的催化 活性不变。,辣根过氧化物酶 （HRP）,从辣根菜中提取的，糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基），主酶与酶活性无关， 辅基是酶的活性中心。,优点：分子量小，标记物易透入细胞；标记方法简单；溶解性好； 价格低且有商品供应；底物种类多。 由于有以上优点，因此，是ELISA最常用的酶 。,常用酶,酶和酶作用底物,HRP的底物,DH2+H2O2 D+2H2O,HRP,DH2为供氢体习惯上被称为底物，底物有多种,酶和酶作用底物,HRP催化的反应式,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高。 常用的是过氧化氢（H2O2)和过氧化氢尿素（CH6N2O3) ，过氧化氢很不稳定需用前临时配制。过氧化氢尿素配制成应用液可长期保存。,HRP的常见底物,邻苯二胺 OPD,四甲基联苯胺 TMB,5-氨基水杨酸5-ASA,2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐 ABTS,常用底物,酶和酶作用底物,TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,HRP的常见底物,酶和酶作用底物,ELISA试剂盒有两种液态试剂A（过氧化氢），B（TMB），如出现颜色改变应废弃。,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,二、酶标记抗体或抗原,抗体（抗原）特异性不变，酶活性不变。,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,三、固相载体,要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济,种类,塑料制品 微颗粒（免疫磁珠）膜载体（微孔滤膜）,固相载体,第二节酶免疫技术分类,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均 相,异 相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,抗原抗体反应后需将结合的与游离的酶标记物分离后才能 测定,不需将结合的与游离的酶标记物分离，即可测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,第三节酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),底物显色定性或定量的分析,原理,包被,反应加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体,洗涤使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离,1,2,3,4,一、基本原理,固相的抗原或抗体,酶标记物（酶结合物）,酶反应的底物,三个必要试剂,二、方法类型及反应原理,1、双抗体夹心法应用： 二价或二价以上的较大分子抗原测定，如 乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等。,ELISA检测抗原的方法,双位点一步法？,1、已知抗体包 被于载体表面,3、加酶标抗体 与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物 不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包 被于载体表面,2、加待检物无抗 原与抗体结合,3、加酶标抗体 无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,2、竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA检测抗原的方法,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,1、间接法方法 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点 一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用 常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,2、双抗原夹心法原理：类似双抗体夹心法操作步骤：类似 应用：乙型肝炎表面抗体,ELISA检测抗体的方法,夹心法：有双抗原夹心法和双抗体夹心法，两者步骤相同，操作原理相同。但酶标志物和检测对象不同。双抗原夹心法测抗体，双抗体夹心法测抗原。,3、竞争法原理：类似检测抗原的竞争法 应用：乙型肝炎病毒核心抗体(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)的检测,ELISA检测抗体的方法,捕获法 应用： 病原体急性感染诊断中的IgM型抗体 甲型肝炎HAV-IgM抗体 乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗体,ELISA检测抗体的方法,捕获法,原理：抗人IgM链抗体包被捕获待测标本中IgM类抗体加入特异性抗原和酶标记特异性抗原的抗体 底物显色,捕获法原理,+,-,1、固相化抗人IgM,1、固相化抗人IgM,2、加待测物特异