大花惠兰、石斛兰的组织培养.doc

大花惠兰、石斛兰的组织培养（1）材料与方法材料：大花蕙兰大花品种嫩芽。将母株放在温室内盆栽培养,于25 月陆续从母株上取8 cm 左右的新芽,剥去最外几层叶片,去芽的上半段，然后在超净工作台上采用三步灭菌处理法处理:先在70 %的酒精中处理6 s ,立即投入10 %的次氯酸钠溶液中10 min ,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层23 枚叶片;再放入5 %的次氯酸钠溶液中5 min ,取出后无菌水冲洗,剥至最后1 枚叶片;再放入1 %的次氯酸钠溶液中1 min ,取出后无菌水冲洗数次。以上次氯酸钠溶液中均加入Tween20 以利杀菌剂更有效地发挥作用,在无菌条件下剥出约5 mm长地茎尖,以生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4 个小方块,分别接入已经准备好的培养基上。 培养基： 原球茎诱导培养基配方: MS + 0. 5 mg/ L BA +1. 0 mg/ L KT + 2 g/ L 活性炭（active carbon，AC）。 原球茎增殖培养基配方为:MS + 0. 5 mg/ L BA + 0. 8 mg/ L2 ,42D +2 g/ L AC,。 幼苗分化及生根养基配方为:MS + KT 1 mg/ L + NAA 0. 5mg/ L +2 g/ L AC。 培养条件培养基pH 5. 45. 8 ,琼脂粉0. 6 %0. 8 %,活性炭0. 2 %的,防止褐变,培养室温度2225 ,相对湿度40 %,光照12 h/ d ,光照强度为2 000 lx。（2） 结果观察 原球茎诱导：把茎尖切成的小块,接入圆球茎诱导培养基上，20天后（或更长时间）观察有无圆球茎出现。结果调查:圆球茎的诱导率= 产生圆球茎的茎尖数/ 接种茎尖数100 %。 原球茎增殖：将诱导形成的较大原球茎块切割成直径38 mm左右的小块,接种在圆球茎增殖培养基上。1 个月后统计增殖量，结果调查:原球茎增殖率= 有新原球茎的块数/ 接种块数100 %。 幼苗分化及生根：将增殖的充分成熟的较大原球茎块切割成直径38 mm的小块,接种在原球茎分化及生根培养基上。45 d 后统计分化率、生根率及根系生长状态。结果调查:幼苗分化率= 出芽数/ 圆球茎个数100 %。幼苗生根率= 生根幼苗数/ 幼苗数100 %。 壮苗、驯化与移栽：壮苗。1/2MS，7 %琼脂, pH 5.45.6，56周后植株长出粗壮的根系。光照2 000 lx；容器：23 cm 30 cm 8 cm四周镂空的塑料框；将瓶苗从培养室(恒温室)移至与外界相通的室内放置2 d后,去瓶盖炼苗3 - 7 d,洗净瓶苗根部的培养基,用1000倍甲基托布津或多菌灵浸泡组培苗根部,放置于通风阴凉处晾干水分至根系发白变软,即可用于移栽；基质。水苔和谷(麦)壳2：河沙1：珍珠岩1（体积,是大花蕙兰组培苗假植的理想基质；白天平均温度在20 以上,夜间温度在15 左右。假植相对湿度控制在80%以上。晴天上午10: 00至下午5: 00,作70%的遮荫处理，大花蕙兰刚出瓶的植株很小、十分脆弱, 放置处要求光照弱，种后用喷雾器将苗株与植材喷洒到湿润为止。每天向叶片喷水数次, 保持湿润, 切忌过干或过湿。10 天后才逐渐增加给水量。良好的浇水管理措施、可大大提高瓶苗移栽成活率。瓶苗移栽20 天以后新根长出, 可逐渐增加光照强度。每周进行1 次根外追肥，可用“花宝1 号”或“通用肥”2000 倍液喷洒。 （3）讨论 在原球茎增殖的继代培养中,2025 d 继代1 次较为合适,此时产生的原球茎未充分成熟,增殖率较高,且颜色为鲜绿色;30 d 以后新生的原球茎充分成熟,增殖率会有所降低,颜色转为深绿色;原球茎切割块的大小以直径0. 5 cm为适宜,过小易死亡降低增殖率,过大增殖率也有所降低；在培养基中加入2 g/ L AC活性碳可以有效的降低褐变率；分化及生根培养时原球茎切割的块越大分化的越早,幼苗长得越壮;同一培养基中培养的时间越长分化率越高;分化和生根可以同步进行。 （4）实例 大花蕙兰杂交新品种西维亚、玛利莲梦露、蒙米拉丝、女皇为材料，把母株放在温室内盆栽培养,于2 月底4 月初陆续从母株上取8 cm 左右的新芽,从基部切离,用自来水冲洗,再用洗洁净溶液浸泡5 min ,自来水冲洗10 min ,剥去最外几层叶片,并剪去芽的上半段. 然后在超净工作台上采用3 步灭菌处理法处理:先在70 %的酒精中处理6 s ,立即投入10 %次氯酸钠溶液中10 min ,稍加摇动,取出后用无菌水冲洗,剥去外层23 片叶; 再放入5 %的次氯酸钠溶液5min ,取出后无菌水冲洗,剥至最后一枚叶片;再放入1 %的次氯酸钠溶液1 min ,取出后无菌水冲洗数次.以上次氯酸钠溶液中均加入Tween - 60 以利杀菌剂更有效地发挥作用. 在无菌条件下剥出约5 mm 长的茎尖,以生长点为中心,用解剖刀把茎尖切成4 个小方块,分别接入已准备好的培养基上.培养条件：pH 5. 25. 6 ,蔗糖2 % ,琼脂条0. 6 %0. 85 % ,温度2225 ,光照强度2 000 lx ,每日光照12 h。培养基配方：诱导原球茎最佳激素配比为KT 0. 05 mg/L ,NAA 0. 5 mg/L，利于原球茎增殖的培养基为改良KC + KT 0. 05 mg/L + NAA 0. 5 mg/L ,以半固体培养,加香蕉泥为佳,增殖率为4. 1. 利于生根壮苗的培养基为改良KC + NAA 0. 2 mg/L ,以固体培养为佳。讨论： 灭菌处理：大花蕙兰属热带气生兰,靠根系附着在林中树木及岩石上生长,多数种类有内生菌共生. 因此外植体灭菌采用3 步处理. 据笔者经验,大花蕙兰外植体灭菌比其它植物有一定难度. 我们曾采用抗生素处理,效果不佳. 对于供试品种是否由于存在内生菌而引起外植体灭菌处理困难,以及内生菌在植物体内的分布传播情况有待进一步研究； 培养基添加香蕉泥：对大花蕙兰增殖和分化有明显的促进作用,这与香蕉泥中的有机质和天然激素有关,同时能使培养物在适宜的酸性条件下生长；原球茎切块细小、稀疏的培养瓶内,群体生长较慢,而切块较大且密集的瓶内,生长十分健壮,表现类似于群体生长效应. 因此切割时不可过细,直径要在2 mm 以上,每瓶可接种30 多个培养块,可使瓶内营养得以充分利用；接种时,采用大罐头瓶把培养块1 次夹入或铲入,稍加晃动半固体培养基即可使培养块分散开来,既节约时间、成本,又降低了污染率； 用改良KC(无机盐减半) 培养大花蕙兰,无机盐用量比其它报道用MS 培养基大大减少,增殖分化效果均佳. 采用降低琼脂用量制成半固体培养基可简化接种步骤,而且培养块浸在培养基内,降低了培养块黄枯和切口褐化的机会. 定期摇动培养瓶,能使培养瓶内营养得以充分利用. 无机盐和琼脂在培养成本中占有很高的比例,采用以上技术可大大节约成本,利于大规模生产应用；用自来水代替蒸馏水,用绵白糖代替蔗糖,用廉价的琼脂条代替琼脂粉,降低了成本,效果没有丝毫降低. 由于大花蕙兰原球茎增殖不必用小容器和相对较高的罐头瓶,可用透光性好的大容器代替； 采用1 次定植,不经移栽,可以减少对幼苗根系的损伤和节约人力. 只要保证温室内相对湿度,对成活率无显著影响,但组培苗前期生长缓慢。石斛兰的组织培养 石斛兰为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium )植物,为附生兰,与卡特兰(Cattleya) 、蝴蝶兰( Phalaenopsis) 、万代兰(Vanda)并列为观赏价值最高的“四大观赏洋兰”。石斛属是兰科中仅次于石豆兰属(B ulbophyllum )的第二大属,全世界共有1 000多个原生种,分布区域广,主要在亚洲的热带和太平洋岛屿的东亚、东南亚及澳大利亚等地区。我国石斛属植物共有74种2变种,主要分布于秦岭以南诸省区,尤以云南南部最多。石斛中的铁皮石斛、金钗石斛等是名贵药材，石解兰却是一种观赏价值很高的花卉, 其花色繁多艳丽、 花型大、 花枝长、 花多。 春石斛节生型主要作为盆栽品种, 秋石斛蝶花型主要作为切花， 也可以用来进行造型后盆栽。在繁殖上, 因为几乎所有的观赏类石解都是杂种, 不能用种子播种得到大量与亲代形状一致的植株，分株和高位芽扦插繁殖则速度很慢，一般在1年中的繁殖速度为2-3倍， 通过茎尖组织培养技术产生原球茎，在原球茎阶段进行增殖培养和分化 ，使原球茎繁育成小植株，效率很高。石斛兰增殖的另一途径就是用通过芽的增殖方式形成再生植株。 1 石斛兰组培快繁 材料与方法 材料：选取生长健壮的3-5cm石斛兰新生芽，取茎尖为材料，先用自来水冲洗干净，再用75的酒精处理8s；后用0.1升汞灭菌10min，最后用无菌水冲洗4、5次，在无菌的环境里在显微镜下剥取茎尖组织作为外植体，接种于无菌的设计的培养基上。 培养基及培养条件： 芽的诱导。MsNAA1.0mg/L6-BA4.0mg/LKT1.0mg/L，pH5.0-5.4，温度为252，漫射光（不开日光灯）。 芽的增殖和分化。MsNAA1.0mg/L6-BA4.0mg/LKT1.0mg/L，pH5.0-5.4。壮苗生根。1/2MsIBA2.0mg/L 肌醇2.0mg/L 水解酪蛋白1.0g/L+ 香蕉泥1.0g/L 。移栽基质。砖粒：木炭： 椰糠为4：1：1（体积比） 结果观察 芽的诱导。将茎尖接于芽的诱导培养基，经过40d的培养，诱导出不定芽。石斛兰为复茎性兰花，较适于用茎尖作为其快速繁殖的外植体。研究表明，带1-2个叶原基的茎圆锥成活率高，不易褐化而致死亡。 芽的增殖培养。将生长至1-1.5cm 的不定芽切下，分别转接于芽的增殖和分化培养基，30d，芽增殖倍数为12倍。 壮苗生根。选取生长健壮、高2cm以上的单个芽体接入壮苗生根培养基，60d，生根率达100，且植株根系发达粗壮，形成完整的石斛兰小植株。由于根的分化形成，加快了植株对营养的吸收，促进了茎叶的生长，达到了壮苗生根的目的。添加一定量的香蕉泥有助于石斛兰根系的分化。 试管苗的移栽。当石斛兰试管苗长5-7cm 高， 有3片以上真叶/ 时，就可进行移栽。出瓶前将瓶苗移至自然漫射光的室内炼苗7d，以增强试管苗对室外环境的适应力，提高其移栽成活率。移栽前先洗净试管苗根部培养基，用0.2甲基托布津溶液浸泡15min，然后移栽基质中。小苗移栽后应浇透水，放入温室大棚内，定根前要控制水分，只要保持叶面及基质湿润即可。石斛兰较适宜生长的温度为15-25，空气相对湿度为70-80。 讨论：春石斛用芽增殖方式获得再生植株以春石斛盆苗的茎段侧芽为材料。剪取春石斛的茎,剥离叶片后流水冲洗30 min 以上,70 %的酒精浸数秒,用无菌水冲洗1次,再用0. 1 %的升汞液浸8min ,最后用无菌水冲洗8 次,获得无菌外植体。将经过灭菌处理后的春石斛的茎在无菌培养皿内切成22. 5 cm的茎段,每一茎段上有1 个茎节。将此茎段接种在培养基中诱导侧芽生长,培养条件均为:温度(25 2) ,光照为12 h/ d，光强1600Lx，诱导培养基：MS + BA0. 5 mg/ L + NAA0. 1 mg/ L。90d后诱导出芽，转接至MS + BA0. 5 mg/ L + 2 ,4-D 0. 2 mg/ L促芽生长，90d长至约2cm，转接于增殖培养基MS + BA 3. 0 mg/ L + NAA 0. 2 mg/ L，30d，增殖约2倍；铁皮石斛根尖诱导后用芽增殖选择生长健壮、根长为3 cm 左右的铁皮石斛无菌苗, 用刀片小心切除根冠后, 取长约0. 30. 5 cm 的根尖分生组织平放于培养基中培养。基本培养基为B5，入蔗糖30 g/L , 琼脂6.1 g/L , pH 5.8。 培养条件为(251) , 光照强度为800Lx, 持续光照。诱导培养基：B5+0. 5mg/L24-D+ 0. 5mg/LNAA+ 3. 0mg/L6-BA，出愈率、类原球茎形成率、芽形成率最好。将类原球茎转接到B5+ NAA 0. 5mg/L + 10% 椰子汁的培养基中进行分化增殖培养, 类原球茎逐渐变长, 其顶端分生组织先分化出芽, 然后叶原基进一步发育成幼叶。稍后, 在其基部出现根原基, 根原基细胞分裂延伸为根, 内部分化出维管束, 最后形成完整的幼苗。同时，类原球茎在分化的同时, 也会不断增殖, 产生许多新的类原球茎, 最后逐渐形成丛生小芽。两种不同途径产生的类原球茎的分化能力有明显不同, 由根尖直接产生的类原球茎在分化培养基中绝大多数都能分化成小苗, 而由愈伤组织分化而来的类原球茎分化能力很弱, 大多数最终褐化死亡。根尖直接再生芽:根尖, 除产生一定比例的类原球茎外, 还出现根尖分生组织直接分化成芽的现象，适宜培养基是B5 (微量元素减为1/3 ) + 1% 芋头汁，但频率低；铁皮石斛丛生芽的增殖：将从日本引进的生长旺盛的铁皮石斛健康植株,以茎芽为中心剪下,芽的上下各留0. 5 cm的茎段,用洗衣粉浸泡20 min左右, 取出后再用自来水反复冲洗数次,用75%的酒精溶液灭菌30 s,然后用无菌水冲洗1次,将茎段腋芽的苞叶拨去,然后将0. 1%的HgCl2 溶液倒入烧杯中灭菌10 min,灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底,最后用无菌水冲洗56次将HgCl2 溶液冲净并接种到培养基上。培养条件，温度22 ,光照12 h/d,光照强度为2 000 lx。铁皮石斛丛生芽的增殖培养基为MSNAA0. 3 mg/L 6-BA5 mg/L，一个芽30 d后芽增殖数可达15个。当生长到60 d时达到铁皮石斛的最高生长点。将大小达34 cm的无根苗切割成单苗，转培养基为MS + 6-BA2 mg/L+ 20%香蕉汁，20 d左右小苗的茎节上开始出现根的分化,接种30 d后小苗长出浅绿色长度0. 81 cm、直径0. 10. 2 cm的小根, 60 d后根长度最长可达5 cm以上，生根率95%，平均根数4. 5条。2实例 铁皮石斛的愈伤组织的诱导 铁皮石斛采自野生。嫩叶用自来水冲洗干净，先用75%的乙醇对铁皮石斛嫩叶进行表面消毒, 再用0.1%的HgCl2 灭菌58min, 用无菌水冲洗3次。将已灭菌的石斛嫩叶, 在无菌条件下切成3mm2。培养基为N6 6-BA1.0mg/L蔗糖20 g/L和琼脂8 g/L, pH5.8，培养温度25 , 日光灯照射, 光照强度1 5002 000 lx, 12 h /d。接种9 d后,嫩叶开始出现愈伤组织。 紫皮石斛兰其原球茎的增殖和分化 材料是紫皮石斛兰的种子无菌苗 ，将紫皮石斛兰无菌苗的原球茎接入增殖培养基中，培养基为MS，pH 5. 4 ,蔗糖2030 g/ L , 活性碳5 g/ L,琼脂7 g/ L 。温度2426 ,13 h /d,光照强度3 000 lx。1 个月后增殖倍数为9. 5 倍。将增殖后的紫皮石斛兰原球茎接种于分化培养基上：6-BA 0. 2 mg/ L + NAA 1. 5 mg/ L ，40 d 后调查分化率，达到87.5%。将分化的苗转入40g/ L MS 脱水培养基（商店可买）作为生长培养基 ,1个月后苗粗壮、根系发达、叶片紫绿,长势比较好。移栽，将组培所得的紫皮石斛兰苗移入温室,练苗3 d 后移栽。移栽前先洗净组培苗根部培养基,用50 %的多菌灵可湿性粉剂1 000 倍液浸泡10 min ,然后移入苔藓基质中,移栽成活率为32 %。 广东石斛的组织培养 将约3 cm长且生长健壮的幼芽从母株上采下，自来水冲洗1 h，去掉外部叶片，先用75% 酒精消毒30 s，再用0.1% 升汞溶液(加1 滴吐温)消毒10 min，无菌水冲洗68次，用消毒滤纸吸干表面水分，接种到原球茎诱导培养基：1/2MS+6-BA3.0 mg/L+NAA 0.5mg/L，蔗糖浓度3.0%，琼脂7.0 g/L，pH 5.8。培养温度(262)，连续光照12 h/d，光照强度为2 000Lx。15 d 左右茎节处开始膨大，30 d 以后逐渐有绿色原球茎长出。将获得的原球茎转接丛生芽诱导及增殖培养基：花宝1 号3 g/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+ 椰汁100 g/L+ 活性炭(AC) 0.5 g/L，蔗糖浓度3.0%，琼脂7.0 g/L，pH 5.8，进行丛生芽诱导培养，培养环境同上，20 d 时由原球茎上长出绿色丛生芽。将丛生芽再次转入新鲜丛生芽诱导及增殖培养基：即花宝1 号3 gL-1+6-BA 1.0mg/L+NAA0.05mg/L+ 椰汁100 g/L+ 活性炭(AC) 0.5 g/L中继续培养，30 d 为1 个继代增殖周期，增殖倍数可达5倍。将丛生芽接到壮苗培养基：1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+ 椰汁100 g/L+AC 0.5 g/L，蔗糖浓度3.0%，琼脂7.0 g/L，pH 5.8培养丛生芽逐渐长大成苗。将大约3 cm长且生长健壮的无根苗切割成单个苗接入生根培养基：1/2MS+IBA 0.5mg/