2019年中医开题报告范文

20192019年中医开题报告范文年中医开题报告范文 92019年中医开题报告范文中医开题报告怎么写 下面是搜集的中医 开题报告范文 希望对大家有用 选题依据 目的和意义骨折不愈 合是骨科临床常见病症 其中以四肢长骨多发 例如胫骨 股骨 肱骨等 针对四肢长骨骨折不愈合二次手术我院多才用植骨术配合L CP重新内固定 自体髂骨作为植骨材料具有较多的优点如取材简单 组织相容性好 无移植排斥反应 骨诱导作用强等 这些优点使得髂骨成为一种 最佳的植骨供材 这在临床上已形成共识 植骨是治疗骨折不愈合的重要方法 其机制是爬行替代所引起的支 架作用与供给矿物质的作用 爬行替代顺利进行的条件要求准确的 复位 充分的植骨和坚强的固定 为达到充分的植骨 及早促进骨折愈合 我们采用髓内外36 植骨 的方法 外用钢丝环扎 配合LCP坚强内固定 术后3 1个月内进行 随访 根据愈合情况和功能恢复情况分析手术的临床疗效 选题目地在于探讨治疗四肢长骨骨折不愈合的手术改进方法和疗效 为临床治疗提供参考 本课题目前国内外研究的动态 水平治疗骨折不愈合 可分为手术 治疗和非手术治疗 其中手术治疗最重要的就是植骨术加更改断端 内固定 骨折不愈合应用自体骨移植治疗效果显著 已经形成共识 植骨是治疗骨不连的重要方法 植骨方式临床多采用髓内外联合植 骨 沿肌间隙进入 骨膜下小心剥离显露骨折部位 取出内固定器械 清除骨断端间瘢痕 咬除硬化骨 打通髓腔 修整骨折端 手法复 位 按照骨缺损情况取骨 髓内植骨以比髓腔稍粗的骨棒 贴紧髓腔骨质 髓外上盖植骨宜用螺 丝钉固定植骨块 骨碎屑充分填充残余的空隙 这样才能确实达到植 骨的目的和要求 自体皮 松质骨植骨的爬行替代缩短了骨折愈合过程 新鲜的自体骨具有生 物活性 不存在免疫排异 无传染疾病的风险 同时存在骨传导和 骨诱导能力 内固定物更换得坚持以下原则 原钢板内固定者 可更换成交锁髓 内针或更长的钢板置于张力侧 原交锁髓内针内固定者 可选用更大 号髓内针或钢板内固定 原先短钢板内固定者 可改成较长的钢板 所有病例均需植骨 更换内固定物后 术后石膏外固定者 应及早进行肌肉收缩锻炼 活动 骨痂生长良好后 去石膏开始关节屈伸功能锻炼 但是临床上医师应该具体问题具体对待 可以根据骨痂生长情况酌 情处理 出院时务必详细医嘱病人注意事项 配合医生 直到骨折 完全愈合 LCP钢板内固定适用于四肢长骨骨折不愈合 可用拉力螺钉固定碎骨 块及移植骨块 并对断端行轴向加压锁定 手术关键是将骨折端的瘢痕结缔组织全部切除 骨端硬化骨全部咬 除 露出正常骨质 钻通髓腔 植入的骨块必须牢固的嵌入缺损区 间隙用松质骨填满 应积极正确指导术后功能锻炼 严格定期随访及指导 避免过早的不正确的负重 综上所述 对于骨折不愈合的治疗 自体骨移植疗效确切 安全稳 妥 技术成熟 应用广泛 值得提倡 课题研究的主要内容病例本研究病例均采集于山东中医药大学附属 医院骨科病房采集时间20 xx年5月 20 xx年1月诊断标准 1 病史明确的外伤史 骨折后6个月没有愈合 并且没有进一步 愈合倾向已有3个月 症状患者骨折端成角 旋转 侧移位 短缩畸形或者节段性骨缺损 持重疼痛或不能持重 局部在应力下疼痛等 3 体征局部窦道形成 流脓 假关节形成或伴有局部软组织瘢痕 缺损等 4 辅助检查X线表现骨端硬化 髓腔封闭 骨端萎缩疏松 中间存 在较大的间隙 或骨端硬化 相互成为杵臼假关节等这三种形式中的 任何一种就可以定为骨折不愈合 纳入病例标准 1 符合本病诊断标准 骨折平均愈合时间超过半年以上 有假关 节形成 3 骨折平均愈合时间超过半年以上 多次复查X线拍片显示 骨 折线清晰可见 未见内外骨痂或内外骨痂极少 4 拍片显示骨折线增宽 骨折端骨面致密性硬化 骨髓腔封闭 骨质疏松 骨痂间无骨小梁形成 或伴有明显的骨缺损 5 临床表现有骨的感染 缺损 畸形 肢体不等长 局部窦道形 成 流脓等 排除病例标准 1 不符合上述诊断标准者患者有严重的内科疾病 不能够耐受手 术者 3 精神疾病患者疗效观察方法对骨不连愈合的评价应包括骨愈合 和功能恢复双重评价 1 骨愈合评价标准本评价结果决定于四项指标骨愈合 感染 畸 形和肢体长度 其中骨愈合标准为X线示骨折线模糊 有连续骨痴通 过骨折线 拆除或试行松动外固定物后骨折无异常活动 下肢可无 痛行走 上肢持物骨折处有稳定感 评价标准优骨折愈合 无感染 断端畸形 双侧肢体不等长 C M 良骨折愈合及其他三标准中两项 可骨折愈合及其他三标准中一项 差骨折未愈合或再骨折或虽愈合但不具备其他三标准中任何一个 功能评价标准功能的评价分上肢与下肢的不同 上肢主要考虑其灵 活性 而下肢主要功能为负重行走 将下肢评价指标定为以下五项 明显跛行 踝或膝任何一关节僵硬 完全伸膝或踝完全背伸时 活动范围较正常或对侧丧失15 以上 软组织情况不良 有限制活动或影响睡眠的疼痛存在 丧失工 作能力或生活不能自理 优存在工作能力且无其他四项指标 良存在工作能力且具以上四指标中一至二项 可存在工作能力并具以上指标中三至四项 差丧失工作能力或生活不能自理 不考虑是否具备其他指标 对上肢功能评价参照Seu和Hdlly对上肢功能评价标准 3 观察指标为 三项疼痛 关节活动范围 日常活动能力 l上肢功能评价标准分数痛疼任一关节活动受限日常活动差无用力或 疲劳后持续性 4 4 完全不受限轻微受限严重受限课题进度 及安排收集病例及随访 撰写论文 定稿可行性分析四肢长骨骨折 不愈合由于并发症较多 治愈比较困难 手术后功能恢复过程漫长 因此在治疗过程中 经验的总结是非常必需的 也是可行的 本课题主要研究山东省中医院近年应用钢丝环扎36 植骨配合LCP内 固定治疗四肢长骨骨折不愈合的治疗效果分析情况 因此在选题上 可行性较强 课题的研究也得到了学校 附院等各部门 科室的大力支持 相信可以圆满地完成课题 主要参考文献 1 胥少汀 葛宝丰 徐印坎 等实用骨科学 M 北京 人民军医出版社 王亦璁 等骨与关节损伤 M 人民卫生出版社 3 夏和桃组合式外固定器简介 EB OL 北京骨外固定技术研究所 5 4 蒋协运骨科临床疗效评价标准 M 人民卫生出版社 5 5 BydHB Li pinskiSW WileyJHJBneJinSugA 1961 43159168 6 AudigeL Giff inD BhndiM elPhnlysisffsfdelyedhelingndnnuninin416peively eedibilshffues J OhpRelRes 5 4381 3JesJMChy JhnHezenbegT ibilNnunins J OL eMediine Ap9 4 8 周来喜 林本丹 钟志刚 等胫骨骨折三种固定器械的生物力学比较和临床研究 J 骨与关节 损伤杂志 15 5 48 43 9 李峰 欧阳跃平骨不连临床研究进展 J 国际骨科学 杂志 811 119 1 HveyEJ HenleyMB SinksidMF elIyuy 3 34 111 116 11 任可 张春才 赵建宁 等持续动态压应力下骨折愈 合时软骨内骨化的特点及其机制 J 解剖学杂志 8 31 4 5 54 1 李兴华交锁髓内钉治疗胫骨骨折不愈合 J 中医正骨 1943 44 13 吴国华4种固定方法治疗胫腓骨双骨折的疗效对比 J 现代中西医结合杂志 4 13 1 4 48 14 权毅 潘显明 王元山 等交锁髓内钉断钉与骨不 连的力学研究及临床意义 J 中国矫形外科杂志 3 11 3 4 9 15 SeekeW SugeG KinzlLLlpliinsfin edullyniling J Ohpde 1996 54 91 16 Fnullh MuhdShibKhn S yedMuhdAisEVALUATIONOFMANAGEMENTOFTIBIALNON UNIONDEFECTWITHILIZAROVFIXATOR J AyubMedCllAbbbd 19 3 1 DviesR HlN NygSTheefpinsiesihexenlfixin J hp51lun en shushiki JunlfbnendJinSugey 5 816 19 18 李起鸿骨外固定 技术临床应用中的几个问题 J 中华骨科杂志 1996 1664研究生姓 名 导师姓名 职称 教授学科专业基础医学院研究方向方剂的 配伍规律及临床运用一研究目的与意义1 研究目的百合病最早见于张仲景的 金匮要略 属中医情志病范 畴 金匮 百合狐惑阴属阳毒病证治 篇将 百合病 描述为 意欲 食复不能食 常默然 欲卧不能卧 欲行不行 饮食或有美时 或 有不用闻食臭时 如寒无寒 如热无热 口苦 小便赤 诸药不能 治 得药则剧吐利 如有神灵者 身形如和 其脉微数 从百合病的临床表现看 与抑郁症的诊断标准有较多的相似之处 所以现代不少医家都将中医的百合病归属于抑郁症 1 2 3 百合知母汤为治疗百合病的经典方药之一 由百合和知母两味药组 成 百合宁心安神 润肺止咳 知母清热泻火 滋阴润燥 百合甘寒清润而不腻 知母苦寒降火而不燥 百合偏于补 知母偏于泻 二药伍用 一润一清 一补一泻 共奏润肺清热 宁心安神之效 主治阴虚或温热病后余热末清 以致头昏 心烦不安 失眠等症以 及情志不遂 以致精神恍惚 不能自制等症 故本课题旨在通过体动物实验揭示百合知母汤抗抑郁可能的细胞内 信号转导机制 2 研究意义抑郁症是常见的危害人类身心健康一类精神疾病 以显著 而持久的情感或心境低落为主要特征 在WHO的一项流行病学调査中 发现全世界约有10 20 的人一生中曾有过抑郁体验 4 随着现代社会的生活压力逐渐增高 工作节奏加快 人们处于应激 状态中的机会增多 抑郁症的发病率更逐年上升 5 6 越来越多 的患者正遭受抑郁症的折磨 给家庭及社会造成了严重的经济负担 因此 加强抑郁症的防治 寻找安全 有效的治疗方法 具有非常 重要的社会和经济意义 抑郁症发病机制复杂 诱因繁多 针对某一单一环节的药物难以取 得满意的疗效 许多抗抑郁西药存在抗抑郁谱窄 起效慢 药价高 依从性差 副作用大及易复发等不足 7 传统的中医学中蕴含着丰富的心身医学思想 其 形神合一论 天人合一论 就包含了广义的心身医学思想 因此国内外越来越重视传统中草药及复方抗抑郁的研究 开展了广 泛而深入的实验研究 积累了丰富的经验 且实验研究成果在临床 运用中也取得了良好的疗效 为中医学和现代心身医学的融合 发 展提供了新的契机 中医心身医学研究工作逐渐起步 心身医学的中医药防治研究工作 在病因病机及临床诊断方面也取得一定的进展 8 随着分子生物学的发展 抗抑郁药物抗抑郁作用机制已由细胞外单 胺递质途径 逐步转向细胞内信号转导机制 而目前针对百合知母 汤抗抑郁作用机制的研究大都局限在行为学观测 脑内神经递质和 神经内分泌等方面 本研究采用大鼠慢性应激结合孤养抑郁模型 对百合知母汤的抗抑 郁作用及其细胞内作用机制进行研究 以期为其进一步的新药开发 研究和临床应用提供实验基础 二研究现状1 百合病的研究现状1 1百合病的起源百合病始见于张仲景 金匮要略 百合狐惑阴阳毒病 证治第三 篇百合病者 百脉一宗 悉致其病也 意欲食复不能食 常默然 欲卧不能卧 欲行不能行 饮食或有美 时 或有不用闻食臭时 如寒无寒 如热无热 口苦 小便赤 诸 药不能治 得药则剧吐利 如有神灵者 身形如和 其脉微数 这段文字概括了百合病的主要症状是精神 饮食 睡眠 行为 语 言 感觉的失调 与西医学抑郁症的主要症状有颇多相似之处 百脉一宗者 分之则为百脉 合之则为一宗 因人体百脉同出一 源 源病则百脉合病 周身受累 因此而得名百合病 1 2百合病的病因病机百合病的病因病机为伤寒热病之后 余热伤阴 或情志不遂 郁热伤阴 导致心肺阴虚内热 百脉失养而成 病机特点是心肺阴虚内热 心神失养 以神志改变为主要临床特点 心肺阴虚 余邪未尽 则出现口苦 小便赤 脉微数 该组症状是百合病的主要客观体征 百脉遍布周身 百脉失和 则行动感觉变异 如 欲卧不能卧 欲 行不能行 意欲食复不能食 饮食或有美时 或有不用闻食嗅时 如寒无寒 如热无热 等 神志失和 则现 如有神灵者 常默默 1 3百合病的治疗法则百合病以心肺阴虚为基本病机 以滋养心肺 润 燥安神为治疗法则 可 随证治之 分为以下几型 正治法 百合病 不经吐 下 发 汗 病形如初者 百合地黄汤主之 百合病未经误治 日虽久而病形如初者 以滋养心肺阴血 清热安 神为法 以百合地黄汤主之 取百合润养心肺 清气分虚热 生地滋养心血 清血分虚热 泉水 煎药 取清热助阴 血热从小便下行之功 诸药合用 心肺得养 气血同治 阴复热清 百脉和调 病症自除 误汗后 百合病发汗后者 百合知母汤主之 百合病误用汗法 汗后阴液受伤 心肺阴虚加重 燥热尤甚 除具 备百合病的基本症状外 尚可出现津伤燥热的心烦 少寐 口干或 渴 午后潮热 小便短少等症候 治宜养阴清热 润澡除烦 用百合知母汤主治 误下后的滑石代赭汤 百合 滑石 代赭石 误吐后的百合鸡子汤 百合 鸡子黄 久病变渴的外用百合洗方 百合 如内服外洗仍口渴不解 方用栝蒌牡蛎散 栝蒌根 牡蛎 久病变发热的百合滑石散 百合 滑石 2 抑郁症的研究现状2 1抑郁症的起源抑郁症是一种情感性精神障碍 临床上以情绪低落 思维迟缓和精神运动性抑制为特征 其它症状包括丧失自尊 不恰 当的内疚感 死亡和自杀念头 注意力集中程度降低以及睡眠和食 欲减退 还可能伴有各种躯体症状 抑郁症是一种最普通的精神疾病 我国对情感性精神障碍进行流行病学调查1985年终生患病率约为12 我国对抑郁症的识别率低 临床漏诊率达50 60 一般内科医生对包括抑郁症在内的心理障碍的识别率只有15 9 约只有1 4的抑郁症病人才能接受正规治疗 有专家认为我国抑郁症的发病率应为10 15 随着人口的逐步老龄化 抑郁症在60岁以上人群中的发病率将 高达20 50 1994年WHO全球调查发现 抑郁症的现症患病率现症患病率为11 4 终生患病率为20 30 约13 20 的人一生中曾有过至少一次抑郁体验 xx年世界卫生报告 指出 抑郁症目前已成为世界第四大疾患 到2020年抑郁症可能成为仅次于心脏病的第二大疾病 抑郁症正在 成为一个严重的全球问题 9 13 2 2抑郁症的发病抑郁症的病因十分复杂 一般认为病因可能与遗传 人格特征 心因因素有关 其发病机制也处于假说阶段 主要包括单胺递质学说 神经内分泌 学说 信号通路学说 14 15 单胺假说作为抑郁症研究的重点认为单胺类神经递质 如5 轻色胺 多巴胺 去甲肾上腺素等 的失衡可导致抑郁的发生 大量研究亦显示抑郁症与遗传 神经 心理等因素诱发的中枢5 羟色胺 5 HT 去甲肾上腺 Norepinephrine NE 多巴胺 Dopamine D A 等单胺类神经递质含量降低及其受体功能下降有关 16 17 有研究 18 表明抑郁模型大鼠下丘脑 纹状体 海马内5 HT NE及DA及其代谢产物 合成前体的含量明显降低 这也支持了经典的单胺递质学说 5 HT抑郁症的发病机制涉及突触间隙5 HT水平及5 HT受体亚型功能的失调 5 HT功能活动降低 则患者心情抑郁 食欲减退 运动活动减少 Coppent 19 等于1965年首先提出5 HT与抑郁症有关 认为抑郁症是由中枢神经系统5 HT释放减少 突触间隙的含量下降而引起的 近年来 研究发现了很多5 经色胺的受体亚型 使得5 HT递质系统与抑都症发病的关系越来越受到关注 NE大量研究证明脑内NE的绝对或相对缺乏会引起情绪低落 心境 抑郁 Schildkraut 20 于1965年首先提出抑郁症的发生是由于脑中NE不足 所致 中枢神经系统中NE含量不足则发生抑郁症NE的缺乏可能是由 于内源性的生成释放异常或由于NE系统慢性刺激所致的继发性粍竭 21 Bmnello 22 等指出 自从发现一些药物通过改变NE代谢既能导致抑 郁症又能缓解抑郁症 NE在抑郁症中所起的作用越来越受到关注 DA1975年Randrup首先提出 抑郁症的发病可能与DA有关 后来Maj等研究者证实 几乎所有长期抗抑郁治疗的患者都会增加DA 诱导的奖赏反应 1983年Willner等提出抑郁症存在DA功能的降低 尤其是伴随有精神 运动迟滞的患者 23 对抑郁症自杀者尸检结果提示 抑郁症自杀患者尾状核和伏核的DA 代谢率降低 24 目前 抑郁症的神经内分泌机制研究中 下丘脑一垂体一肾上腺轴 HPA轴 功能亢进是较为公认的发病机制之一 大量研究显示 抑郁症患者的HPA轴功能亢进 血浆促肾上腺皮质激 素释放激素CHR 促肾上腺皮质激素 ACTH 和皮质醇 CORT 浓度 明显升高 而且这种功能亢进是依赖性的 随着抑郁的恢复 HPA轴 的功能也逐步恢复正常 25 Catalan 26 等发现抑郁症患者下丘脑及下丘脑外的促肾上腺皮质激 素释放因子 CRF 浓度都升高 重度抑郁组比轻度与中度抑郁发作 CRF血浓度更高 且CRF与皮质醇血浓度显著相关 在发病机制方面 受体后信号通路及其第二信使系统在该病发病及 治疗中的作用是当前研究的热点 以脑内cAMP反应元件结合蛋白 cAMPresponseelementbindingprote in CREB 为交汇点的细胞内信号转导通路正受到越来越多的关注 尤其是海马CREB的改变 早在1996年 Nibuya 27 等就报道抗抑郁治疗 大鼠海马CA1区 CA 3区和齿状回均可见CREBmRNA的表达增多 CREB可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点 海马CREB的表达和活化受到多种信号分子和信号通路的影响 腺苷 酸环化酶 环磷酸腺苷 蛋白激酶A通路 AC cAMP PKA通路 是研 究最早的抗抑郁通路 其主要过程是胞外信号激活胞膜上G蛋白耦联受体 AC激活 胞内cA MP升高 降解cAMP的酶主要是磷酸二酯酶 PKA激活 CREB磷酸化 调节基因转录 生物学效应 Li和Branski 28 29 等实验研究发现海马cAMP通路的激活对改善抑 郁症状起积极作用 酪氨酸激酶受体B 丝裂原活化蛋白激酶 核糖体S6激酶通路 TrKB MAPK RSK通路 是一条和细胞生长 增殖 凋亡以及突触可塑性 密切相关的信号通路 在各种MAPK通路中 细胞外信号调节激酶1 2 ERK1 2 信号通路与 抑郁症关系最为密切 ERK1 2通路激活的大致过程是TrKB的激活 MAPK激酶激酶 MAPKKK RAF 的激活 MAPK激酶 MAPKK MEK 的激活 ERK1 2的激活 RSK的激活 CREB磷酸化 调节基因转录 生物学效应 抑郁症患者的尸检报告显示脑内MAPK减少可能是严重抑郁症的病因 之一 30 Ca2 钙调蛋白 钙调蛋白依赖的蛋白激酶通路 Ca2 CaM CaMK通 路 通路涉及多种离子通道 受体和酶 其激活的主要过程是胞 浆内钙浓度升高 钙离子与CaM结合 激活CaMK CREB磷酸化 调节 基因转录 生物效应 王庆松等 31 利用猫对大鼠造成急性捕食应激 发现在捕食应激后 大鼠海马细胞内CaM信号通路调控紊乱 表现在细胞内Ca2 浓度明显 升高 Ca2 CaM复合体增多 CaMK的表达升高 提示海马该信号转导通路在严重 心理应激所致的行为异常中可能有重要意义 3 百合知母汤的研究现状3 1百合的研究现状方中百合为百合科植物百合LiliumbrowniiF E Brownvar colchesteriWils 卷丹LiliumlancifoliumThunb 和细叶百合LiliumpumilumDC 的肉质鳞茎 味甘 性微寒 入心 肺经 本品气味稍缓 甘中有收 既能清心肺之余热 而敛气养心 安神 定魄 用于治疗热性病后 余热末尽所引起的神思恍惚 烦躁失眠 莫名所苦的 百合病 又能润肺止咳 用于治疗肺燥咳嗽 或 肺虚久咳 或阴虚久咳 痰中带血等症 百合中主要含有酚酸甘油酯 苷类 生物碱及多糖 另外还含有一 些磷脂 蛋白质和无机元素 药理研究表明百合具有抗癌 止咳 耐缺氧与抗疲劳 提高机体细 胞免疫功能等作用 32 34 3 2知母的研究现状方中知母为百合科植物知母Anemarrhenaasphodelo idesBge 的根茎 味苦 甘 性寒 入肺 胃 肾经 本品质润 苦寒不燥 沉中有浮 降中有升 上行能清肃肺气 以泻肺火 润肺燥 除烦热 止咳嗽 用于治疗 温热病 邪在气分 症见高热 烦躁 口渴 脉洪大者 以及阴虚 燥咳 或肺热咳嗽诸症 入于中 善清胃火 除烦渴 用于治疗消渴 病之中消诸症 行于下 则能泻相火 滋肾燥 用于治疗阴虚火旺 骨蒸潮热 盗汗等症 知母主要含有皂苷 黄酮 双苯吡酮 木脂素等成分 现代研究表明 知母具有抗病原微生物 抗血小板聚集 降血糖 解热 抗炎 降低转氨酶等多种药理活性 35 37 3 3百合知母汤的研究现状百合知母汤有养阴清热 除烦润燥之效 以 润养心肺为大法 治疗百合病误汗后 津液受伤 虚热较甚者 临床上运用百合知母汤治疗乳腺增生病 38 39 长期低热 40 消渴 喘证 盗汗 胃脘痛 41 失眠 42 抑郁 43 等症 三研究思路与立题依据1 研究思路百合知母汤是 金匮要略 中治疗百合病的经典方剂 百合病的描述 百合病者 百脉一宗 悉致其病也 欲卧不能卧 欲行不能行 意欲食复不能食 常默默 如有神灵者 主要归纳 为情绪障碍 躯体不适 与现代医学抑郁症的诊断标准有很大的相 似性 因此一般将百合病归属于抑郁症范畴 百合知母汤中的部分有效成分能通过提高抑郁症大鼠大脑皮层单胺 递质 抑制HPA轴亢进 提高模型动物脑组织BDNF含量等途径发挥抗 抑郁效应 CREB可能是各种抗抑郁信号转导通路的交汇点 抗抑郁药物 包括中药 或其它治疗措施可通过调节一种或几种通 路 最终激活CREB 调节BDNF等基因表达 影响神经元增殖 分化 成熟等可塑性改变 发挥抗抑郁作用 参与调节CREB的各调节因子之间 通路之间存在复杂的交叉联系和 相互作用 共同维持着CREB活性的平衡 近年来研究提示抑郁模型小鼠 存在神经元蛋白和营养因子在海马 的表达异常 而这些变化可以被一些中药逆转 44 当前致力于阐明信号通路 CREB 营养因子 神经再生之间是如何 相互联系的 以及细胞靶点 分子应答 行为反应的调节与抗抑郁 之间错综复杂的关系 这将有助于我们以CREB为中心了解抑郁症的病理生理机制 并在此 基础上研发出疗效可靠 起效迅速 副作用小 经济实用的新药 尤其是帮助我们更好地认识一些中药抗抑郁的可能机制 更充分地 利用祖国宝贵的中医药资源 细胞内信号转导通路是目前抗抑郁机制研究的重点和热点 可被多种不同的信号路径激活 环磷酸腺苷 cAMP 丝裂原活化蛋白激酶 MAPK 钙调蛋白激 酶 CaMK 等3条通路是目前认为与抗抑郁相关 最主要的信号通路 这3个主要上游通路最终都使CREB磷酸化 进而调节其下游通路的 基因表达 完成神经元生化功能 而CREB是上述3种通路的交汇点 前期的研究证实百合知母汤抗抑郁的机制与提高慢性不可预见性应 激结合孤养抑郁 CUMS 模型大鼠海马组织5 HT含量 提高脑组织中CREB cAMP反应元件结合蛋白 mRNA的表达 有关 见7 3 有鉴于此 我们提出假设百合知母汤抗抑郁的信号机制可能与以上 三种细胞内通路有关 三个通路在抗抑郁机制中可能会有所偏重 围绕假设 基于CREB磷酸化通路 本课题拟将百合知母汤作用于CUM S大鼠 运用ELISA RT PCR 免疫组化 Western印记等方法 检测大脑组织cAMP信号中cAM P和PKA MAPK信号中TrKB和BDNF CaMK信号中钙调蛋白 CaM 和Ca MK等关键因子 初步探讨百合知母汤抗抑郁的信号机制 筛选出该 方抗抑郁的基因靶点 2 立题依据中药复方具有成分多 作用环节多 靶点多的特点 多环 节之间具有协同效应 因此研究中药及其方剂的抗抑郁作用具有极大的挖掘潜力 而且对 解决日益增加的抑郁患者的痛苦有重大的社会意义 45 46 四研究内容及目标1 建立慢性不可预见性应激结合孤养大鼠抑郁 CUMS 模型 2 通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织环磷酸腺苷 cAMP 和蛋 白激酶A PKA 含量变化 评价百合知母汤对抑郁症cAMP信号的干 预作用 3 通过检测用药前后模型动物大鼠络氨酸激酶受体B TrKB 和脑源性 神经营养因子 BDNF 含量变化 评价百合知母汤对抑郁症MAPK信 号的干预作用 4 通过检测用药前后模型动物大鼠海马组织中钙调蛋白 CaM 和钙调 蛋白激酶 CaMK 含量变化 评价百合知母汤对抑郁症CaMK信号的 干预作用 五拟解决的关键问题通过检测cAMP MAPK CaMK三条信号 转导路径上重要调节因子cAMP PKA TrKB BDNF CaM CaMK用药 前后的变化 初步评估百合知母汤对以上三个信号转导路径的干预 作用 评价方剂抗抑郁的机制 以便进一步筛选出方剂抗抑郁靶点 六实验研究方案1 实验动物SD雄性大鼠 7 12周龄 体重180 200g2 药物制备按照 金匮要略 中记载的方法百合七枚 劈 约20g 知母三两 切 约10g 即百合知母 21 取百合100g 知母50g 先以清水将百合浸泡12小时 当白沫出 去 其水 再加清水2000ml 武火煎开后改为文火 得百合煎煮液1000m l 再用清水2000ml 先武火后文火 得知母煎煮液1000ml 将2次煎 煮液混合 文火浓缩得煎煮液1500ml 按照比例配制足够数量百合知母汤煎煮液 放入冰箱 20 储存备用 临用时取出 浓缩至合适体积 为确保实验结果的可比性 所有实验都用同一批药材 所有药物的给药剂量根据 人和动物体表面积折算的等效剂量比率 表 计算而来大鼠 200g 用药量 人 70kg 日用剂量 0 018 每只大鼠的给药体积为1ml 100g 百合知母汤终浓度为2 2g Kg d 成人日用量30g 氟西汀终浓度为1 8mg kg d 成人日用量20mg 各组按浓度给药28天 对照组给等体 积的三蒸水 3 CUMS抑郁症模型大鼠制备除正常对照组外 其余动物采用慢性轻度 不可预见性温和刺激结合孤养 CUMS 的造模方法各造模组大鼠均 单笼饲养 刺激因子包括禁食 禁水 4 冰水游泳 夹尾 晃尾 潮湿垫料和倾斜45 束缚应激 陌生物品 空笼刺激 噪音刺激 闪光刺激 水平震荡 昼夜颠倒等 每日随机给予2到3种刺激 使大鼠不能预料刺激的发生以避免产生 适应 每种刺激交叉累计使用2 3次 持续21天 造模成功后 给药期间继续维持造模 建立慢性温和不可预见性应激结合孤养 CUMS 抑郁症大鼠模型 具体操作方法如下 1 禁水即24小时不予供水 具体方法为 造模当天 上午800始 撤出大鼠笼内供水瓶 禁水24 小时后 于次日上午800正常供水 2 禁食即24小时禁止进食 具体方法为 造模当天上午800始 清除鼠笼内所有鼠粮 剥夺进食 24小时后 禁食期间供水正常 禁食后给少量碎食 然后正常词养 3 昼夜颠倒造模当天 上午800 将正常对照组大鼠转移至其它S PF级实验室后 关闭本实验室所有电源 模仿黑夜 至2000准时打 开实验室电源 模仿白昼 给大鼠制造昼夜颠倒的假象 4 夹尾用缠裹有胶布的塑料夹 夹持鼠尾根部 时长为5min 5 晃尾提住大鼠尾巴中部以每秒钟1次的频率 晃尾15分钟 晃 尾时力度要轻柔 避免牵拉大鼠尾尖部位 以防脱皮 6 冰水游泳取一直径为30cm玻璃缸 注入适量清水后加入适量冰 块 调整水温至4 根据天气情况 适当调整 以防冻伤 同时 调整水液平面据器皿边缘约15 20cm 然后将大鼠放入冰水中 强迫其游泳5min 5min后将大鼠榜出 先用干毛巾擦拭动物毛发 然后用吹风机吹干 避免感冒 每次冰水游泳结束后需捞干净游泳器皿内大鼠类便 避免对下一只 鼠产生影响 7 高速水平震荡将动物放入空的鼠笼中 进行人工振荡 2次 秒 有效节奏连续持续5min 或者水平晃动 1次 秒 持续30分钟 8 噪音刺激90分贝噪音刺激2h 尽量选在白天大鼠休息的时候给 予此种刺激 9 束缚刺激将大鼠束缚于500ml烧杯中2h 注意保持通气 10 潮湿环境将大鼠的垫料换以潮湿垫料 持续刺激12h 11 异物刺激往大鼠笼内放置金属条棒 钝性玻璃器皿的异物予 以刺激 持续2h 12 空笼撤掉大鼠笼里面的垫料笼子里不放置任何物品 持续12h 13 倾斜刺激 该刺激因素通常在禁水后进行 应激动物本身饥 渴 在倾斜的鼠笼中觅食觅水更为困难 14 闪光刺激LED频闪灯 频闪频率2次 s 持续刺激2h 以上各种刺激的实施顺序遵循由弱 轻刺激 如昼夜颠倒 禁水禁 食 潮湿环境 到强 重刺激 如冰水游泳 夹尾 晃尾 束缚刺 激 噪音 闪光等刺激 的原则 以避免刺激之间的交互作用 每日采用1种刺激 平均每种刺激被采用2 3次 同种刺激不能连续出现 使动物不能预料刺激的发生 4 行为学指标的测量主要包括1 蔗糖水消耗率 体重变化率 敞箱实 验 Morris水迷宫实验4 1体重变化率分别在实验的第1d 15d 22d 29 36d 43d 50d 57 64d进行 动物体重变化率 当日测量的体重 第1天的体重 第1天的体重 4 2糖水消耗实验实验前期准备 在安静的环境内训练动物适应含糖饮 水第一个24h 每笼同时放置两个完全相同的动物水瓶 两瓶均为同 等重量的1 蔗糖水 第二个24h 一瓶为1 鹿糖水 一瓶为相同重量 的纯净水 然后进入实验阶段 禁水禁食24h后 测定9p m 7a m10小时内大鼠1 蔗糖水摄入量 糖水偏爱率 糖水消耗量 糖水消耗量 清水消耗量 X100 适养期间进行三次糖水偏爱筛选 将糖水偏爱率异常的大鼠剔除 不用于正式实验 三次糖水偏爱测试中均只喝自来水的大鼠为异常 大鼠 测定动物在实验第1天 第22天 第49天 第64天糖水偏爱率的变化 4 3敞箱实验敞箱实验 Open fieldTest 是评价实验动物在新异环境中自主行为 探究行为与紧 张度的一种方法 以实验动物在陌生环境中某些行为的发生频率和持续时间来反应实 验动物的自主行为与探究行为 以尿便次数反应其紧张度 敞箱实验 Open fieldTest 木质敞箱 立方形 长 宽 高为80cmx80cmx40cm 内 侧壁 底面为黑色 底面用白线划分为面积相等的25块正方形 室内安静环境下将大鼠放置于敞箱底面的中心方格内 人距离敞箱1 米之外 记录大鼠在3min内活动频率 以穿越底面正方形块数为水平穿越格数 4爪均进入方格才记数 为 水平运动得分 以两后肢直立的次数为竖立活动次数 两前爪腾 空或攀附墙壁 为垂直运动得分 理毛次数以及大小便次数 每只动物只测1次 测定完毕后彻底清洁敞箱再进行下一只观察 分别于实验前1天 实验第22天和最后1天进行 4 4Morris水迷宫实验该实验是对大鼠学习记忆能力的检测 主要包括 定位航行实验和空间搜索实验 实验用主要装置包括一个银灰色圆形水池 直径150cm 一个白色 平台 直径10cm 一台跟踪摄像机以及与摄像机相连的计算机 池内盛水 且水温保持在22 24 最后一次敞箱实验结束后第二天开始 首先训练大鼠寻找平台 平 台置于水面下2cm 摄像机位于水池上方约200cm 能清晰摄取到大 鼠的运动轨迹 将水池分为四个象限 将大鼠从任意一个象限放入水中 记录其找 到平台的路径及时间 前几次训练中 若时间超过120s 则引导动 物到平台 并在平台上停留10s 然后进行定位航行与空间搜索实验 定位航行实验训练结束后的第一天 保持平台位置不动 将大鼠随 机从一个象限放入水中 开始记录大鼠的运动轨迹及找到平台的时 间 空间搜索实验定位航行实验结束后 将平台撤走 将动物从原平 台位置的对侧放入 开始记录120s内大鼠的运动轨迹及潜伏期与穿 越平台次数 以此做为对空间记忆能力的检测指标 4 4悬尾实验将实验动物通过固定动物尾端2cm处使其头向下悬挂 动 物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱 从而提供了一个无可 回避的压迫环境 一段时间的实验后 记录处于该环境的动物产生 绝望的不动状态的时间 动物表现出的这种典型的 不动状态 反映了一种被称之为 行 为绝望状态 这种行为绝望模型与抑郁症类似 而且对绝大多数 抗抑郁药物敏感 而且其药效与临床药效显著相关 5 尼氏染色正常的神经细胞都含有一定数量的尼氏小体 它们主要分 布于神经细胞的浆中 形状有大有小 如三角形 有的为椭圆形 这些物质能被大部分的蓝色染料所染色 这些染料如焦油坚牢紫 C resylfastviolet 亚甲蓝 methyleneblue 甲苯胺蓝 tolui dineblue 硫董 thionin 等将其染为蓝色 但是 当神经细胞受伤后 胞质内的尼氏体更可发生变化 严重的 可消失 通过观察尼氏小体的数量可以探知神经元的受损或修复情 况 各组大鼠分别于末次给药后麻醉 使大鼠仰卧位固定于实验台上 打开腹腔 掀起右肺 在靠近脊柱处找出下腔静脉和腹主动脉 用止血钳夹住腹主动脉和下腔静脉 接着打开胸腔 用针头经左心 室插入升主动脉 后剪开右心耳 进行灌注 先用0 9 的生理盐水250ml经心脏快速灌注冲洗 再用4 的低聚甲醛 O lmol L的磷酸缓冲液 PH7 2 7 4 350ml灌注 在灌注固定液过程中后期大鼠颈部 肩部和双前肢逐渐变硬 灌注后取大鼠全脑 10 低聚甲醛固定48 60h 以松果体为标志物 向头侧横向切取3段 每段厚2mm 石蜡包埋 连续切片 片厚lOpin 切片 用于尼氏染色及后期的免 疫组化 将脑片置于0 5 甲苯胺蓝 母液甲苯胺蓝1g 无水乙醇100ml 使用时按11比例与新鲜的0 1 NaCl溶液混合成工作液 或焦油紫 焦油紫0 1g 蒸馏水99ml 1 冰醋酸1ml 中室温下染色30min 在75 95 100 酒精中各脱色1min 二甲苯透明10min 中性树胶 封片 显微镜下观察照相并对尼氏染色阳性神经元进行计数 6 测量生化指标主要包括CREB BDNFmRNA在大鼠海马内的表达 免疫组 化检测TrKB ERK1 2蛋白的表达 免疫印迹法检查CaM CaMK 的表 达 6 1逆转录 聚合酶链式反应法检测CREB BDNFmRNA在大鼠海马内的表达首先匀 浆海马新鲜组织约100mg 加入1ml的TRIZOL试剂 用电动勾浆器进 行勾浆 两相分离分装后样品于15到30 孵育5分钟 每1ml的TRIZOL试剂勾浆的样品中加入0 2ml的氯仿 盖紧管盖 手动剧烈振荡管体15秒后 15 30 孵育2到3分钟 4 下12000g离心15分钟 离心后混合液体将分为下层的红色紛氯仿相 中间层核上层的无色 的水相 RNA全部被分配于水相中 水相的体积大约是勾浆时加入的TRIZO试 剂的60 RNA沉淀将水相转移到新离心管中 水相与异丙醇混合以沉淀其中的RNA 加入异丙醇的量为每个样品匀 浆时加入 1mlTRIZOL试剂加0 5ml的异丙醇 混勾后15 30 孵育10分钟后 于4 12 000g离心10分钟 RNA清洗移去上清液 每1mlTRIZOL试剂匀浆的样品中加入至少1ml的75 乙醇 清洗RNA 沉淀 振荡后 4 7500g离心5分钟 重新溶解RNA況淀去除乙醇溶液 空 气中干燥RNA沉淀5 10分钟 切勿真空离心干燥 注意RNA沉淀不要完全干燥 否则将大 大降低RNA的可溶性 部分溶解的RNA样品A260 280比值将小于1 6 溶解RNA时 先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次 然后55 60 孵育10分钟 莰得的RNA溶液保存于 70 浓度测定取少量液体用TE稀释 一般1100稀释 后 读取其在 紫外分光光度计260nm和280nm处的吸收值 A260下读值为1表示40ug RNA ml 样品RNA浓度 ug ml A260 稀释倍数40ug ml RNA纯度检 测RNA溶液的A260 A280的比值范围应在1 8 2 1之间 在无核酸酶的离心管中配制反应液RNA 1 5 g 逆转录引物 20um 1 l RNasefreeH2O 使总体系为12 5 l 反应液配制在冰上进行 轻轻混匀 65 变性10min 立即置于冰上2min后加入RNA primermix 12 5 l 5 RTReactionBuffer 4 l dNTP 10mM 2 l RiboLockR NaseInhibitor 0 5 l RevertAidReverseTranscriptase 1 l 总体系20 l 25 孵育10min后42 孵育60min 70 加热灭活10mi n 20 保存 设计相应的引物 配制成合适浓度工作液 Realtime PCR仪反应体系液配制2Xall in OneTMqPCRMix 含ROX 10 l 引物 10pmol l 上下游各0 4 l ddH2O 4 2 l cDNA 适度稀释 5 l 总体系20 l 反应条件95 10min 以下反复40个循环 95 10s 60 20s 7 2 20s 最后结果采用2 CT法进行测量 6 2免疫组化法检测TrKB ERK1 2的表达切片后 常规脱蜡至水 3 过 氧化氢孵育lOmin 可以灭活内源性酶的活性 蒸水冲洗 5minx3次 微波热修复3min PBS冲洗 5minx3次 滴加5 BSA封闭液 室温孵 育30min 滴加一抗 5 HTiaR一抗稀释为150 PKA稀释为1100 CREB稀释为1100 4 C过夜 PBS冲洗 5minx3次 滴加二抗生物素标记的羊抗兔IgG 37 C孵 育30min PBS冲洗 5minx3次 滴加三抗试剂SABC 37 C孵育30min PBS冲洗 5minx3次 DAB显色剂显色 室温下15inin 蒸馈水冲洗 脱水 透明 封片最后DAB显色剂显色 室温下20min 蒸馏水终 止反应 常规脱水 透明 封片 显微镜下观察 每只动物取相同部位的3张切片 每张切片选取3个视野 在同一放 大倍数 同一光强度下 采用CMLAS彩色病理图像分析系统 分别计 算每张切片中海马组织TrKB ERK1 2表达的平均光密度 6 3免疫印迹法测定钙调素 CaM 钙调蛋白激酶 CaMK 蛋白表 达变化取新鲜海马约100mg置1 5mlEP管中 生理盐水冲洗两遍 充分剪碎 离心去上清 每管加4 裂解液1ml 继续剪碎 混匀 低温超声匀浆 14000转离 心 5min 取上清备用 取上清5 l 加考马斯亮蓝3 l 去离子水95 l 595nm处 1cm光 径 蒸馏水调零 测各管OD值 根据样品OD值调整蛋白浓度 样品煮沸5min 冷却后取50 g上样 电件 12 浓缩胶90v30min 10 分离胶120v120min NC膜转印 70v120min 5 脱脂奶粉TBST溶液 封闭抗体 摇床2h TBS漂洗5min 3次 一抗孵育 兔抗人CaM CaMK 多克隆抗体1500稀释 4 过夜 二 抗孵育 辣根酶标记羊抗兔IgG11500稀释 37 1h 扫描并分析结 果 条件设置为曝光2min CCD自动获取图像 同时以11000稀释的 小鼠抗大鼠beta actin单克隆抗体作为内参照 各蛋白相对表达量以相应蛋白 beta actin灰度值表示 九课题创新性1 本课题首次系统地由宏观到微观地进行综合研究 能从行为学