消毒剂消毒效力及有效期验证方案

湖北普爱药业有限公司验证管理标准文件 第 1 页 共 5 页 消毒剂灭菌效果验证 编号 PY ZR YZ 004 00起草 审核 批准 类别 技术标准日期 日期 日期 颁发部门 QA生效日期 年 月 日 分发部门 验证委员会 质量管理部 生产管理部 消毒剂的选用原则 目的 确认各洁净级别的操作间及设备外表面按照规定的消毒程序消毒能够达到消毒 防止污 染的目的 并在消毒剂有效期内能确保其消毒效力能符合要求 范围 本验证方案适用于本公司洁净区的墙面 天花板 门窗 机器设备 仪器 操作台 地 漏 推车 桌椅等表面以及操作人员双手 手套 的消毒等 1 1 参考文件参考文件 1 1 医疗器械生产质量管理规范 1 2 中国药典 2015 版 第 4 部 微生物限度检查法 2 2 概述概述 2 1 本公司的洁净区为 D 级 拟定用于洁净区表面消毒的有五种消毒剂 75 乙醇 0 1 新 洁尔灭溶液 0 2 新洁尔灭溶液 0 5 醋酸氯己定溶液 0 1 醋酸氯己定溶液 本次 验证方案将选用以上 5 种消毒剂分别进行验证试验 作用对象一样的消毒剂每月轮换使用 避免表面微生物产生耐药菌株 在利用消毒剂 进行表面擦拭消毒过程中消毒剂的作用时间应不少于 10 分钟 利用消毒剂进行浸泡消 毒 的不少于 5 分钟 消毒剂的种类 消毒对象 消毒方法和有效期 序序 号号 名称名称消毒对象消毒对象消毒方法消毒方法有效期有效期 1 75 乙醇用于设备表面 器具和手消毒 采用擦拭或喷 洒方式 密闭保存 D 级 30 天 2 0 1 新洁尔灭溶 液 用于地面 墙面 器具 工作服 清洁布 拖布和洁净鞋的消毒 采用擦拭或浸 泡方式 密闭保存 D 级 30 天 3 0 2 的新洁尔灭 溶液 用于水池和地漏的消毒用于液封 密闭保存 D 级 30 天 4 0 5 醋酸氯己定 溶液 用于水池和地漏的消毒用于液封 密闭保存 D 级 30 天 5 0 1 醋酸氯己定 溶液 用于工作服 清洁布 拖布和洁 净鞋的消毒 采用浸泡方式 密闭保存 D 级 30 天 精品文档 2欢迎下载 2 2 为了确认消毒剂的消毒效力 通过实验室考察部分和现场考察部分分别进行验证 其 中 用定量悬浮试验法和表面实验法进行实验室考察试验部分 洁净区设施表面材质基本都是不锈钢和玻璃两种 故表面试验法选用不锈钢载片和玻 璃裁片模拟洁净区设施表面进行验证试验 两种试验方法作用的消毒剂见表 序号序号试验方法试验方法消毒剂消毒剂 1 75 乙醇 2 表面实验法 0 1 新洁尔灭溶液 3 0 3 的新洁尔灭溶液 4 0 1 新洁尔灭溶液 5 0 5 醋酸氯己定溶液 6 定量悬浮试验法 0 1 醋酸氯己定溶液 现场考察试验部分选择车间 D 级 的配液间 灌装间设备表面消毒前和消毒后分别进 行取样 测定其微生物数量 3 3 确认前准备确认前准备 3 1 验证用试剂与材料 3 1 1 菌种 序号序号名称名称序列号序列号 1金黄色葡萄球菌 CMCC B 26003 2大肠埃希菌 CMCC B 44102 3枯草杆菌芽孢 CMCC B 63501 白色念珠菌 CMCC F 98001 3 1 2 培养基 序号序号名称名称备注备注 1营养琼脂培养基 2营养肉汤培养基 3胰酪大豆胨琼脂培养基 4胰酪大豆胨培养基 培养基经 121 20min 灭菌备用 5 大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟 编号 BZW12085 规格 55mm 取样面积为 25m2 精品文档 3欢迎下载 6 玫瑰红钠琼脂培养接触碟 编号 BZW15129 3 1 3 消毒液拟定选用的中和剂 序号序号消毒剂名称消毒剂名称中和剂中和剂备注备注 175 乙醇 20 1 新洁尔灭溶液 30 2 的新洁尔灭溶液 1 卵磷脂 0 1 聚山梨酯 80 中和剂经 121 20min 灭菌备用 3 1 4 稀释液 0 9 无菌氯化钠溶液 NS 3 1 5 器具及设备 序号序号名称名称 1无菌移液管 2锥形瓶 3无菌试管 4恒温水浴锅 5恒温恒湿培养箱 6恒温恒湿培养箱 3 2 验证用试剂与材料记录见附录 1 4 4 消毒剂消毒效力试验消毒剂消毒效力试验 4 1 中和剂鉴定试验 4 1 1 试验目的 通过该试验 确认所用的中和剂对对应的消毒剂有良好的中和作用 对试验用菌剂及 其恢复期培养示范有害或不良影响 4 1 2 菌液的制备及计数 4 1 2 1 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢菌工作菌液的制备 接种金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基 中 30 35 培养 18 24 小时 取上述培养物用 0 9 无菌氯化钠溶液做 10 倍系列 稀释成 1 108 5 108CFU ml 的工作菌液 如肉汤培养物的浓度已为 1 108 5 108CFU ml 可不再用 0 9 无菌氯化钠溶液稀释 精品文档 4欢迎下载 计数时 将 1 108 5 108CFU ml 的工作菌液 10 倍系列稀释成含 50 100CFU ml 菌液 并同时采用营养琼脂培养基 30 35 培养 2 天计数 计算该稀释级的平均菌落数 将 计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数 4 1 2 2 白色念珠菌工作菌液的制备 接种白色念珠菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中 23 28 培养 24 48 小时 取上 述培养物用 0 9 无菌氯化钠溶液做 10 倍系列稀释成 1 108 5 108CFU ml 的工作菌液 如肉汤培养物的浓度已为 1 108 5 108CFU ml 可不再用 0 9 无菌氯化钠溶液稀释 计数时 将 1 108 5 108CFU ml 的工作菌液 10 倍系列稀释成含 50 100CFU ml 菌液 并同时采用改良马丁琼脂培养基 23 28 培养 3 天计数 计算该稀释级的平均菌落数 将计数结果换算成每毫升浓菌液的菌落数 4 1 3 鉴定试验操作 4 1 3 1 配制 75 乙醇 0 1 新洁尔灭溶液 0 2 新洁尔灭溶液 40mg L 的二氧化氯 60mg L 的二氧化氯 具体操作执行 清洁剂和消毒剂管理 将配置好的消毒剂置 20 1 恒温水浴锅中备用 4 1 3 2 分组操作 试验分组及稀释操作方法简表 具体操作 第 1 组 目的 观察消毒液对试验菌有无杀灭或抑制能力 操作 混合液 A混合液 B 组号 取 0 5ml 工作菌液 加入下列溶液中 取混合液 A 0 5ml 加入下列 溶液 取混合液 B 或混合液 B 的稀释级溶液 0 5ml 平板计数 2 皿 组 1 消毒剂 4 5ml稀释液 4 5ml混合液 B 10 1 2 消毒剂 4 5ml中和剂 4 5ml混合液 B 10 1 3 中和剂 4 5ml稀释液 4 5ml10 2 10 3 4 中和产物 4 5ml 消毒液与 中和剂比例为 1 1 稀释液 4 5ml10 2 0 3 5 稀释液 4 5ml 混匀作用 10min 稀释液 4 5ml 混匀作用 10min 10 2 10 3 6 稀释液和中和剂各 1 0ml 注入无菌平皿中 各制备 2 皿 精品文档 5欢迎下载 取消毒剂 4 5ml 工作菌液 0 5ml 混匀作用 10min 后 取混合液 0 5ml 稀释液 4 5ml 混匀作用 10min 取 0 5ml 注皿 平行制备 2 皿 金黄色葡萄球菌 大肠埃希 菌 枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基 倒置 30 35 培养 3 天计数 白色念珠菌用 玫瑰红钠琼脂培养基 倒置 23 28 培养 5 天计数计数 第 2 组 目的 观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用后的试验菌是否恢复生长 操作 取消毒剂 4 5ml 工作菌液 0 5ml 混匀作用 10min 后 取混合液 0 5ml 中和剂 4 5ml 混匀作用 10min 用稀释液稀释成 10 1 分别取未稀释溶液 混合液 0 5mll 中和剂 4 5ml 的混合液 及 10 1 0 5ml 注皿 各平行制备 2 皿 金黄色葡萄球菌 大 肠埃希菌 枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基 倒置于 30 35 培养 3 天计数 白色 念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基 倒置于 23 28 培养 5 天计数 第 3 组 目的 观察中和剂是否有抑菌性 操作 取中和剂 4 5ml 工作菌液 0 5ml 混匀作用 10min 取混合液 0 5ml l 稀释液 4 5ml 混匀作用 10min 后 用稀释液进行 10 倍系列稀释成 10 2 10 3 取相应稀释级 0 5ml 注皿 各稀释级平行制备 2 皿 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢 菌用营养琼脂培养基 倒置 30 35 培养 3 天计数 白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养 基 倒置 30 35 培养 3 天计数计数 第 4 组 目的 观察中和产物 或未被完全中和残留消毒剂对试验菌的生长繁殖是否有影响 操作 取消毒剂和中和剂 1 1 的混合液 4 5ml 工作菌液 0 5ml 混匀作用 10min 取混合液 0 5ml l 稀释液 4 5ml 混匀作用 10min 后 用稀释液进行 10 倍系列稀释成 10 2 10 3 取相应稀释级 0 5ml 注皿 各稀释级平行制备 2 皿 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基 倒置 30 35 培养 3 天计数 白色念珠菌用玫瑰 红钠琼脂培养基 倒置 30 35 培养 3 天计 第 5 组 目的 作菌落数对照用 精品文档 6欢迎下载 操作 取稀释液 4 5ml 工作菌液 0 5ml 混匀作用 10min 取混合液 0 5ml l 稀释液 4 5ml 混匀作用 10min 后 用稀释液进行 10 倍系列稀释成 10 2 10 3 取相应稀释级 0 5ml 注皿 各稀释级平行制备 2 皿 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢 菌用营养琼脂培养基 倒置 30 35 培养 3 天计数 白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养 基 倒置 30 35 培养 3 天计数 第 6 组 目的 作为阴性对照用 操作 分别取稀释液和中和剂各 1 0ml 注入无菌平皿中 各制备 2 皿 4 1 3 3 结果判断 试验结果应符合下列全部条件 判断所选中和剂合格 第 1 组无菌生长 或仅有少数试验菌菌落生长 第 2 组菌落数比第 1 组菌落数多 但比第 3 4 5 组菌落数少 且符合下表要求 第 3 4 5 组有相似菌落数生长 其每组间菌落数误差率不超过 15 计算公式如 下 3 组间菌落平均数 各组菌落平均数 的绝对值之和 误差率 100 3 3 组间菌落平均数 第 6 组无菌生长 否则 说明试剂有污染 应重新进行试验 第 1 组平板平均菌落数第 2 组平板平均菌落数 0 5 x x 5 y y 0 5y 4 1 4 中和剂鉴定试验记录见附录 2 4 2 定量悬浮试验 4 2 1 试验目的 由于 0 2 的新洁尔灭溶液 0 1 新洁尔灭溶液 60mg L 二氧化氯溶液 0 5 醋酸氯己 定溶液 0 1 醋酸氯己定溶液是通过浸泡或液封消毒 通过定量悬浮试验 确定其消 毒效力是否符合要求 精品文档 7欢迎下载 4 2 2 试验操作 4 2 2 1 配制 0 2 的新洁尔灭溶液 0 1 新洁尔灭溶液 60mg L 二氧化氯溶液 0 5 醋酸氯己 定溶液 0 1 醋酸氯己定溶液 操作执行 清洁剂和消毒剂管理 将配置好的消毒 剂置 20 1 恒温水浴锅中备用 4 2 2 2 由于 0 2 的新洁尔灭溶液 0 1 新洁尔灭溶液中低效消毒剂 且不能杀灭芽孢 故定 量悬浮试验用菌为金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 0 5 醋酸氯己定溶液 0 1 醋酸氯己定溶液为高效消毒剂 能杀灭芽孢 故定量悬浮 试验用菌枯金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 枯草芽孢杆菌 4 2 2 3 将菌液制备成 1 108 5 108CFU ml 的工作菌液 菌液的制备及计数同 8 1 2 4 2 2 4 将试管按需要分组排列在试管架上 试验组分 3 组 4min 5min 6min 各一组 并 由左向右逐管标明消毒剂 中和剂 10 1 10 2 对照组分 1 组 并由左向右逐管标明 稀释液 中和剂 10 1 10 2 10 3 10 4 4 2 2 5 向个试管加入 4 5ml 相应的试剂 标明 10 1 10 2 10 3 10 4 加入 4 5ml 的稀释液 4 2 2 6 吸取工作菌液 0 5ml 加入标明消毒剂的试管中 对照组加入标明稀释液的试管中 迅 速混匀 并开始计时 4 2 2 7 待菌液与消毒剂相互作用至 8min 10min 12min 吸取菌液和消毒剂混合液 0 5ml 加入标明中和剂的试管中 迅速混匀 4 2 2 8 中和作用 10min 后 吸取 0 5ml 加入标明 10 1的试管中 混匀后吸取 0 5ml 加入标明 10 2试管中 对照组以此类推 对照组直至 10 4 4 2 2 9 试验组分别取中和剂管 10 1 10 2管溶液 1ml 按平皿法测定存活菌数 对照组取 10 3 10 41ml 按平皿法测定存活菌数 每管平行制备 2 皿 4 2 2 10 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢菌用营养琼脂培养基 倒置于 30 35 培养 3 天计数 白色念珠菌用玫瑰红钠琼脂培养基 倒置于 23 28 培养 5 天计数 4 2 3 结果计算 计算试验组和对照组的活菌浓度 CFU ml 并换算为对数值 N 并按下式计算 杀灭对数值 杀灭对数值 KL 对照组平均活菌浓度的对数值 NO 试验组活菌浓度对数值 NX 4 2 4 可接受标准 杀灭对数值 KL 应不低于 3 5 个对数单位 精品文档 8欢迎下载 4 2 5 定量悬浮试验记录见附录 3 4 3 表面试验法 4 3 1 试验目的 由于 75 乙醇 40mg L 二氧化氯溶液 0 1 新洁尔灭溶液是通过擦拭消毒 故选用不 锈钢载片和玻璃裁片进行表面试验法 确定其消毒效力是否符合要求 4 3 2 菌种选择 由于 75 乙醇 0 1 新洁尔灭溶液中低效消毒剂 且不能杀灭芽孢 故定量悬浮试验 用菌为金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 0 5 醋酸氯己定溶液 0 1 醋酸氯己定溶液为高效消毒剂 能杀灭芽孢 故定量悬浮 试验用菌枯金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 白色念珠菌 枯草芽孢杆菌 4 3 3 工作菌液制备 工作菌液的制备方法 浓度及验证同步计数操作同 8 1 2 4 3 4 试验操作 4 3 4 1 1 染菌不锈钢载片制备 将经灭菌的载片平铺于无菌平皿内 滴加金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠 菌含菌量为 1 108 5 108CFU 的菌液 0 1ml 并均匀涂布于整个载体表面 滴染菌液后 载片置超净工作台晾干后备用 每种菌平行制备两个染菌不锈钢载片 2 染菌玻璃载片制备 因培养皿的材质为玻璃 故用培养皿代替玻璃载片进行染菌试验 进行菌液滴染前 用记号笔在培养皿菌液滴染面的背面画出染菌面积 50mm 50mm 标注清晰 菌液滴 染操作同染菌不锈钢载片制备 4 3 4 2 试验组 将消毒剂擦拭在制备好的染菌载片上 消毒剂作用时间分别为 8min 10min 12min 不锈钢载片和玻璃载片每个作用时间分别制备 2 个 作用结束后 用接触碟取样 接 触碟规格 55mm 取样面积为 25m2 取金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌 芽孢菌用大豆酪蛋白琼脂培养基接触碟 编号 BZW12085 取样白色念珠菌用玫瑰 红钠琼脂培养基接触碟 编号 BZW15129 接触碟取样方法 打开接触碟盖 使无菌培养基表面与取样面直接接触 均匀按压接 触碟底板 确保全部琼脂表面与取样面表面均匀接触 10 秒左右 在盖上跌盖 对照组 精品文档 9欢迎下载 对照组的活菌浓度计数见 8 3 3 阴性对照 用接触碟在已灭菌的载片上 未染菌片的载 按压取样 操作同上 每种载片及每种 接触碟平行制备两份 4 3 4 3 培养 将取样金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 枯草杆菌芽孢菌的接触碟倒置于 30 35 培养 3 天计数 取样白色念珠菌的接触碟倒置于 23 28 培养 5 天计数计数 4 3 4 4 结果计算 计算试验组和对照组的活菌浓度 CFU ml 并换算为对数值 N 并按下式计算 杀灭对数值 杀灭对数值 KL 对照组平均活菌浓度的对数值 NO 试验组活菌浓度对数值 NX 4 3 4 5 可接受标准 杀灭对数值 KL 应不低于 3 5 个对数单位 4 3 5 表面试验法记录见附录 5 4 4 现场考察试验 4 4 1 消毒前对洁净区进行表面微生物取样 取样地点 D 级车间的配料间墙壁和设备表面 灌装间墙壁和设备表面 中间站墙壁 表面 取样操作及检验执行 表面微生物检验 4 4 2 生产操作结束后操作人员按照 生产区清洁 对洁净区进行清洁消毒 4 4 3 清洁消毒完毕 15 分钟后 现场 QA 对清洁消毒后的洁净区进行表面微生物取样 取样地点 固体车间 D 级 的制粒间一墙壁和设备表面 小容量注射剂车间 C 级 的 配液间墙壁和设备表面 灌封