明党参遗传多样性的SRAP分子标记09-3-25.doc

明党参遗传多样性的SRAP分子标记王长林，郭巧生基金项目 国家科技攻关计划项目 (2001BA701A59)；国家科技攻关计划项目（2001BA701A62-04）通讯作者 *郭巧生 ,Tel:(025)84396591；E-mail:，武玉妹(南京农业大学 中药材研究所, 江苏 南京 210095)摘要 目的：研究明党参的遗传多样性，为明党参种质资源利用提供理论依据。方法：以10个不同居群的明党参为材料，通过SRAP分析，计算各样品间的遗传相似系数，在此基础上采用UPGMA方法进行聚类，构建树状图。结果：从160个引物组合中筛选得到17个多态性引物组合，共检测到363个基因位点，其中多态性位点有314个，平均每个引物组合产生18.47个多态性位点，多态性位点百分率为86.50%，显示了较高的多态性比率；各居群遗传相似系数在0.4959 0.8182之间；根据聚类结果可将10个不同居群的明党参分为2大类。结论：明党参不同居群间具有高度的遗传多样性；不同居群的亲缘关系与其地理分布有一定的相关性。关键词 明党参；遗传多样性；SRAP明党参Changium smyrnioides Wolff为我国特有的伞形科单种属植物1，1984年被国家列为三级珍稀濒危植物2。其药用部位为干燥根，具有润肺化痰、养阴和胃、平肝、解毒的功效，用于肺热咳嗽、呕吐反胃、食少口干、目赤眩晕、疔毒疮疡3。明党参主要分布在浙江西北部、江苏西南部和安徽的东南部，向西可延伸到江西北部及湖北东南部。邱英雄等在明党参的资源状况、种群生态、遗传多样性和遗传结构等方面研究了明党参的濒危机制和保护对策4，5，并通过分子鉴定的ISSR分析认为明党参的遗传变异主要存在于不同群体间6。潘泽惠等7对明党参的系统演化进行了研究，认为在地理分布上初步显示了明党参属从西向东扩散迁移的演化路线。厉彦森等8对野生明党参居群生物学特征进行了调查比较，并通过明党参的酯酶同功酶电泳酶谱探讨了明党参野生居群间的亲缘关系。SRAP分子标记操作简便迅速、成本低、可靠性好、重复性高，是近几年发展起来的一种新型分子标记技术，已成功应用于多种植物的遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因定位及比较基因组学等方面，在药用植物遗传物质分析上有着广阔的应用前景。目前，该项技术已在部分药用植物上得以应用，建立了一些药用植物SRAP分析的反应体系912，并进行了一些药用植物的遗传多样性分析1316。本研究将SRAP分子标记技术首次应用于明党参的遗传多样性分析，以便为明党参种质资源利用提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验材料实验用明党参样品来源表1所示，原植物经郭巧生教授鉴定均为伞形科植物明党参（Changium smyrnioides Wolff）。各居群多点随机取样30株，盆栽成活后，随机取样10株幼嫩茎叶，混合后趁鲜提取DNA。1.2 试剂与仪器CTAB，Tris，EDTA，氯仿，乙醇，NaCl，丙烯酰胺等试剂（分析纯）；RNA酶，dNTPs， Taq酶，DNA marker（PUC18 DNA/Mspl）（均购自北京天根生化科技有限公司）；SRAP引物（上海英俊生物技术有限公司合成）；超纯水；高速冷冻离心机，PTC-200型PCR仪（MJ Research 公司），JY600C电泳仪。1.3 DNA提取采用CTAB法提取明党参基因组DNA，运用TE缓冲液置于4条件下保存。紫外检测所保存的DNA浓度，稀释成浓度为25ngL1的DNA模板，4保存备用。1.4 PCR扩增和引物筛选PCR反应体系总体积20L，其中10Buffle2.0L；dNTP（10mML1）0.5L；Mg2+ (25mML1)1.6L；引物（10molL1）0.6L；Taq酶（5UL1）0.2L；DNA（25ngL1）2L。PCR程序为：94预变性5min；94变性1min，35复性1min，72延伸1min，5个循环；94变性1min，50复性1min，72延伸1min，35个循环；72延伸7min，4保存。从ME1-ME20与EM1-EM8共160个引物组合中，筛选出条带清晰、重复性好、多态性丰富的引物组合，用于SRAP-PCR扩增。表1 明党参供试样品及来源样品编号样品名称样品来源样品采集点地理信息经度/E纬度/N海拔/m1大龙山安徽安庆大龙山11654303679.583.22青龙山江苏高淳青龙山11858315888.997.53茅山江苏句容茅山11918314796.5118.34浮山江苏潥水浮山11910314192.3101.15红山江苏句容红山栽培基地11913314241.341.86老山南京江浦老山11835320588.795.37紫金山南京紫金山11828320271.694.38九华山安徽青阳九华山11745303749.255.99琅琊山安徽滁州琅琊山11817321767.674.210南高峰浙江杭州南高峰12008301352.365.11.5 SRAP扩增产物的电泳检测取6L扩增产物与2L溴酚蓝混合后用于5%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，电泳缓冲液为1TBE。电泳时，用60V的电压预电泳30min，上样后用120V的电压电泳约1h。电泳结束后通过固定（10%无水乙醇+0.5%乙酸，15min），银染（0.2%硝酸银，15min），洗涤（蒸馏水，23次），显色（400mL蒸馏水+6g氢氧化钠+4.4mL甲醛+100L 1%硫代硫酸钠，20min）等步骤得到扩增结果，将结果拍照保存。1.6 数据记录与处理实验中以PUC18 DNA/Mspl作相对分子质量标记，电泳图谱中的每一条带均视为1个分子标记。每个样品的扩增带按有或无记录，有带赋值为1，无带赋值为0，得到原始数据矩阵。用PopGen32软件计算各样品间的遗传相似系数，用NTsys-pc 2.02软件UPGMA方法进行聚类，构建树状图。2 结果与分析2.1 SRAP引物筛选从160个引物组合中，共筛选出17个条带清晰、重复性好、多态性丰富的引物组合（表2），进行SRAP-PCR扩增。17个引物组合分别是：M E-2/EM -6、M E-5/EM-3、M E-7/ EM-6、M E-9/ EM-1、M E-10/ EM-1、M E-10/ EM-8、M E-11/ EM-1、M E-12/EM-6、M E-12/ EM-7、M E-13/EM-6、M E-13/EM-7、M E-14/EM-6、M E-14/EM-7、M E-15/EM-6、M E-18/EM-1、M E-20/EM-5、M E-20/EM-7。表2 明党参SRAP分析所用引物及其序列引物序列引物序列ME-25-TGAGTCCAAACCGGAGC-3ME-155-TGAGTCCAAACCGGTCA-3ME-55-TGAGTCCAAACCGGTGC-3ME-185-TGAGTCCAAACCGGGGT-3ME-75-TGAGTCCAAACCGGACG-3ME-205-TGAGTCCAAACCGGCAT-3ME-95-TGAGTCCAAACCGGAAC-3EM-15-GACTGCGTACGAATTCAA-3ME-105-TGAGTCCAAACCGGAAT-3EM-35-GACTGCGTACGAATTGAC-3ME-115-TGAGTCCAAACCGGAAG-3EM-55-GACTGCGTACGAATTAAC-3ME-125-TGAGTCCAAACCGGTAG-3EM-65-GACTGCGTACGAATTGCA-3ME-135-TGAGTCCAAACCGGTTG-3EM-75-GACTGCGTACGAATTGAG-3ME-145-TGAGTCCAAACCGGTGT-3EM-85-GACTGCGTACGAATTGCC-32.2 SRAP扩增结果的多态性分析SRAP扩增结果（表3，图1）统计表明：17个引物组合共产生363个清晰位点，平均每个引物产生21.4个。其中，多态性条带314个，每个引物组合的多态性条带数在1225条不等，平均每个引物组合产生18.47条多态性位点。多态性位点百分率为86.50%，显示了较高的多态性水平。明党参的总基因多样性指数Ht为0.3254（St. Dev = 0.0289）。图1 明党参SRAP分析PCR扩增结果（引物组合为ME-14/EM-6）表3 17个引物组合的扩增结果引物组合总位点数多态性位点数引物组合总位点数多态性位点数M E-2/EM -61512M E-13/EM-62323M E-5/EM-31717M E-13/EM-72522M E-7/EM-61917M E-14/EM-62216M E-9/EM-12017M E-14/EM-72525M E-10/EM-12117M E-15/EM-62321M E-10/EM-82624M E-18/EM-12120M E-11/EM-11916M E-20/EM-52120M E-12/EM-62216M E-20/EM-72417M E-12/EM-72014合计3633142.3 亲缘关系的聚类分析对供试的明党参材料基于上述17个引物组合产生的363个标记数据，用PopGen 32软件计算各样品间的遗传相似系数（见表4），用NTsys-pc 2.02软件UPGMA方法进行聚类，构建树状图（见图2）。10个居群的明党参遗传相似系数在0.4959 0.8182之间。在遗传相似系数0.58的水平上，可将10个居群的明党参分成2个大类：类和类。类包括A，B 2个小类，A类包括浮山和红山2个居群，其遗传相似系数为0.7548，B类可分成C，D2个小类，C类包括青龙山、紫金山、老山和茅山4个居群，其中青龙山和紫金山2个居群相似系数为0.8182，亲缘关系最近，D类包括琅琊山和大龙山2个居群，遗传相似系数为0.7218；类包括九华山和南高峰2个居群，其遗传相似系数为0.7769。表4 明党参各样品之间的遗传相似系数浮 山红 山青龙山紫金山老 山茅 山琅琊山大龙山九华山南高峰浮 山1.0000红 山0.75481.0000青龙山0.69700.72731.0000紫金山0.68040.67220.81821.0000老 山0.61710.60330.71630.74931.0000茅 山0.59230.61710.66940.66940.74931.0000琅琊山0.58680.60610.65290.65290.68870.69151.0000大龙山0.57300.59780.64460.66120.65840.63910.72181.0000九华山0.53170.55100.59230.57580.61710.63090.62530.71631.0000南高峰0.53440.55920.51790.49590.56470.57850.55100.60330.77691.0000图2 SRAP聚类分析图3 讨论3.1 明党参居群间亲缘关系与其地理分布厉彦森等8通过明党参酯酶同工酶分析认为，不同产地明党参居群间亲缘关系的远近，与其自然地理区域有着极大的一致性，地理区域越近的地区居群，亲缘关系越近，差异越小，而相隔越远，则差异越大。本研究的10个明党参居群SRAP聚类分析结果进一步证明了此观点，即不同居群明党参的亲缘关系与其地理分布有一定的相关性。如图2所示，地理位置相近的浮山和红山2个居群聚为1小类，南京附近的青龙山、紫金山、老山和茅山4个居群也聚成1小类，而与其地理位置较远的杭州南高峰和安徽九华山2个居群均与它们遗传距离较远。3.2 明党参的遗传多样性邱英雄等6研究表明，明党参居群间的遗传多样性显著高于居群内的遗传多样性。陶晓瑜等17也认为，明党参居群全基因组水平的基因位点存在丰富的遗传变异，居群DNA水平涵盖较高的遗传变异。本研究检测到我国明党参主要分布区不同居群间的多态性位点百分率高达86.50%，总基因多样性指标Ht为0.3254，亦表明明党参的总遗传变异较高，这与前面的研究结果一致。明党参对生境要求极高，喜凉爽湿润，怕高温高湿，在自然条件下，其分布范围狭窄且封闭，居群间基因交流机率很低，各居群在长期的演化过程中自成体系。另外，明党参又是典型的异花授粉植物，居群内基因交流濒繁，造成居群内个体之间遗传的相似性较高。明党参这种自然的地理隔离一定程度上形成了各分布区特有的种质资源，为明党参优良品种的选育提供了良好的基础。参考文献1 单人骅，佘孟兰. 中国植物志M. 第55卷. 北京：科学出版社，1979：122.2 傅国力.中国植物红皮书M.北京：科学出版社，1992.3 中国药典S. 一部. 2005：146.4 邱英雄，黄爱军，傅承新. 明党参的遗传多样性研究J. 植物分类学报，2000，38（2）：111.5 邱英雄，傅承新. 明党参的濒危机制及其保护对策的研究J. 生物多样性，2001，9（2）：151. 6 邱英雄，傅承新，吴斐捷. 明党参与川明参群体遗传结构及分子鉴定的ISSR分析J. 中国中药杂志，2003，28（27）：598.7 潘泽惠，佘孟兰，刘心恬，等. 中国伞形科特有属的核型演化及地理分布J. 植物资源与环境，1995，4（3）：1.8 厉彦森，郭巧生，王长林，等. 明党参野生居群生物学及其药材质量调查J. 中国中药杂志，2007，32（22）：2349.9 邓婧，陈新，宣朴. 黄花蒿SRAP-PCR 反应体系的建立与优化J. 中草药，2007，38（1）：125.10 杨兵，王天志，罗禹，等. 青牛胆SRAP 标记反应体系的建立与优化J.中草药，2007，38（2）：272.11 郭庆华，郭美丽，薛芊，等. 青葙SRAP 体系的建立和优化J.中草药，2008，39（2）：263.12 李廷春，高正良，汤志顺. 丹参SRAP反应体系的建立与优化J.生物学杂志，2008，25（1）：40.13 樊洪泓，李延春，邱 婧，等.药用石斛遗传多样性的SRAP标记研究J.中国中药杂志，2008，33（1）： 6. 14 李隆云，陈大霞，秦松云，等.仙茅属植物7个国产种的SRAP遗传关系研究J.中国中药杂志，2008，33（2）：117. 15 李敏，王琦，付福友. 不同品种郁金的SRAP研究J.中草药， 2006，37（8）：1255.16 陈大霞，李隆云，钟国跃，等.用SRAP标记分析正品大黄的遗传关系J.中国中药杂志，2008，33（20）： 2309. 17 陶晓瑜，桂先群，傅承新，等.明党参和川明参种间遗传分化和系统关系的分子标记和ITS 序列分析J.浙江大学学报（农业与生命科学版），2008，34（5）：473.Study on genetic diversity of Changium smyrnioides by SRAPWANG Chang-lin，GUO Qiao-sheng，WU Yu-mei(Institute of Chinese medicinal materials, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095,China)Aabstract Objective：To study the genetic diversity of Changium smyrnioides and give a reference to utilize the germplasm. Method：Ten different populations of C. smyrnioides were analyzed by the approach of sequence-related amplified polymorphism（SRAP）. Genetic similarity coefficient was calculated，and systematic relationships w