Embelin 通过上调X亡受体DR4DR5mRNA表达增加HL60细胞对TRAIL的敏感性.doc

Embelin 通过上调X亡受体DR4DR5mRNA表达增加HL60细胞对TRAIL的敏感性 ，（），（），（）（编校张志明）通过上调死亡受体表达增加细胞对的敏感性胡荣，李佳，李迎春，杨莹，朱珂，苗苗，廖爱军，杨威，刘卓刚，【】，【】；，（）【摘要】目的探讨增加细胞对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（）的敏感性及可能的作用机制。 方法、及分别处理细胞、及，法绘制细胞生长曲线；亚细胞毒浓度的处理细胞、及，复染流式细胞术检测细胞凋亡，检测时、及的表达；亚细胞毒浓度的处理细胞、及，实时荧光定量检测及的表达。 结果对细胞具有增殖抑制作用。 亚细胞毒浓度的联合作用于细胞时细胞凋亡率较单独应用时增加，相应的、及的表达也随之增加。 结论亚细胞毒浓度的可以增加细胞对的敏感性，其机制可能与上调及表达并进而启动凋亡途径有关。 【关键词】；死亡受体；凋亡【】；【】【】（）【】【修回日期】【基金项目】辽宁省科学技术厅资助项目（编号）【】中国医科大学附属盛京医院血液科，辽宁沈阳【作者简介】胡荣（），女，辽宁人，讲师，主要从事血液病的诊治与研究。 【通讯作者】刘卓刚（），男，辽宁人，教授，主要从事血液病临床与基础研究。 现代肿瘤医学年月第卷第期，作为肿瘤坏死因子（，）家族中的一员，相关凋亡诱导配体（，）能够选择性的诱导包括白血病细胞在内的部分肿瘤细胞凋亡，但对正常细胞无影响，是一种有潜力的化疗药物。 尽管如此，目前仍有多种肿瘤细胞对耐药，因此如何增加肿瘤细胞对的敏感性成为研究的热点。 本实验室既往的研究已经证实可以通过启动内源性凋亡途径诱导细胞凋亡并具有抑制基质金属蛋白酶及血管内皮生长因子的作用。 鉴于能够启动外源性凋亡途径，本研究选取亚细胞毒浓度的联合作用于细胞，旨在探讨亚细胞毒浓度的是否可以增加白血病细胞对的敏感性及可能的作用机制。 材料与方法实验材料细胞（由本实验室保存）；（，）；（，）；抽提液（，）；噻唑蓝（）（北京博奥森生物技术有限公司）；双染流式细胞术检测试剂盒（北京四正柏生物科技有限公司产品）；、及磷酸甘油醛脱氢酶（）引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。 上游引物，引物长度；下游引物，引物长度。 上游引物，引物长度；下游引物，引物长度。 上游引物，引物长度；下游引物，引物长度。 细胞培养及实验分组采用含有胎牛血清、青霉素、链霉素的培养基，于、和饱和湿度环境下培养细胞，每天换液一次。 、及分别处理细胞、及，法绘制细胞生长曲线（以未经药物处理的细胞为对照组）；亚细胞毒浓度的处理细胞（两个实验组互为对照组）、及，法检测细胞增殖率。 复染流式细胞术检测细胞凋亡。 检测时、的表达。 亚细胞毒浓度的处理细胞、及，实时荧光定量检测及的表达。 细胞增殖率检测取对数生长期的细胞，调细胞密度为接种于孔培养板中，每孔加入细胞悬液，对照组每孔加入无血清培养基，各实验组每孔加入用无血清培养基稀释的。 每个处理均做个复孔，于、饱和湿度环境下培养、和后，每孔分别加，再培养，离心，弃去上清，每孔加，振荡，用酶标仪测的值。 按如下公式计算增殖率。 细胞增殖率（）实验组对照组。 细胞凋亡率检测在待测细胞（）中加入和，使其终浓度分别为和，流式细胞仪激发波长为。 在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为正常细胞（）；右上象限为坏死细胞（）；右下象限为凋亡细胞（）。 每组实验重复次。 、及的表达收集经过不同处理的细胞标本，使用细胞裂解液制备细胞总蛋白，以蛋白分析系统检测蛋白浓度。 取等量总蛋白上样进行凝胶电泳，转膜过夜，脱脂牛奶室温封闭，加入、及的抗体（）过夜，之后加入二抗室温孵育，洗涤后，加入显影剂，暗室显影。 每组实验重复次。 的表达参照说明书采取一步法提取总。 逆转录合成。 扩增（扩增仪）（）、（）、（）、模板及，总体积为。 反应条件（秒）个循环；（秒）及（秒）个循环；（秒钟）、（秒）及（秒钟）个循环。 实时荧光定量结果采用法进行分析，实验组（目的基因内参）对照组（目的基因内参），目的基因相对表达量。 每组实验重复次。 统计学处理数据用软件分析。 实验结果用珋表示，差异性的显著性检验采用检验，为差异有显著性。 结果抑制细胞增殖对细胞具有增殖抑制作用，其抑制作用呈时间及剂量依赖性（图）。 其中以上浓度的增殖抑制作用明显高于对照组（），及对细胞的增殖抑制作用不明显（）。 的为，为。 鉴于是与对照组产生统计学差异且高于的浓度，故在进一步的实验中选择联合作用于细胞。 图不同浓度处理后细胞活性亚细胞毒浓度的联合抑制细胞增殖并促进细胞凋亡作用于细胞、及，细胞增殖率分别为（）、（胡荣，等通过上调死亡受体表达增加细胞对的敏感性）、（）及（）。 作用于细胞、及，细胞增殖率分别（）、（）、（）及（）。 同一时间点联合用药时细胞增殖率较单独用药下降，不同时间点各组之间均具有统计学差异（）。 作用于细胞、及显示，同一时间点联合用药时细胞凋亡率比单独用药增加（图）。 不同处理时间的各组之间也具有统计学差异（）。 图单用或联合处理后细胞凋亡率亚细胞毒浓度的联合使、及蛋白的表达增加亚细胞毒浓度的联合处理细胞后，不仅显示细胞凋亡率较单独应用时增加，相应的、的表达也随之增加（图）。 图和单用及联合处理后细胞表达；亚细胞毒浓度的使表达上调作用于细胞、及，相对定量分别为、及；相对定量分别为、及。 随着作用时间的延长及表达增加，各实验组之间比较有统计学差异（）。 讨论凋亡起始于两条完全不同但又相互关联的信号途径内源性凋亡途径通常由损伤、缺氧或化疗等诱发的细胞反应实现；外源性凋亡途径大多数由促凋亡蛋白或抗凋亡蛋白相互作用后发生，通过细胞表面的死亡配体（主要是和）实现。 死亡受体属于受体超家族。 目前选择性激活死亡受体诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的新方法，研究较为充分的死亡受体是（）、相关凋亡诱导配体受体（，）及肿瘤坏死因子受体。 其中被激活后能够诱导多种肿瘤细胞凋亡而对正常细胞没有毒性，应是目前最有潜力的治疗肿瘤的药物之一。 联合其它化疗药物或放疗可以增加肿瘤细胞对的敏感性或逆转肿瘤细胞对的耐药性。 能够作用于和从而启动外源性凋亡途径；与不同，作为连锁凋亡抑制蛋白（，）小分子抑制剂，可以通过降低表达激活内源性凋亡途径。 为此，我们首先选择不同浓度的作用于细胞，结果显示单药对细胞具有增殖抑制作用，并呈时间及剂量依赖性。 之后选择亚细胞毒浓度的联合的作用于细胞，结果显示细胞凋亡率较单独应用时增加，相应的、及的表达也随之增加。 提示联合用药后内源性凋亡途经和外源性凋亡途经均有不同程度的激活。 我们进一步应用荧光定量的方法检测了作用后细胞及，结果显示表达明显增加，提示亚细胞毒浓度的可能通过上调及的表达增加对细胞的敏感性。 鉴于具有激活的作用，而已被证明是一种新型的蛋白酶体抑制剂，故二者联合作用促进细胞凋亡的机制有可能与途径的改变有关。 本实验室将进一步研究二者对途径的影响以进一步明确联合用药的机制及可能性。 【参考文献】，（）胡荣，吴斌，张国君，等对细胞增殖、分化和凋亡的影响中华血液学杂志，（）胡荣，杨莹，李佳，等对细胞、及表达的影响现代肿瘤医学，（），（），（），现代肿瘤医学年月第卷第期，（），（），（），（），（），（）（编校张志明）氮杂脱氧胞苷对食管鳞癌细胞增殖及基因表达与甲基化状态的影响刘晓波，高子夜，金曙，李胜保，童强，；，【】，（），（），（）；，（），【】【修回日期】【基金项目】湖北省教育厅科研基金项目（编号）；十堰市太和医院博士启动资金资助项目（