临床免疫学荧光免疫技术.doc

第九章荧光免疫技术本章考点1.荧光的基本知识2.荧光抗体技术3.荧光免疫测定荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于l941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescent antibody technique）。由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。 第一节有关荧光的基本知识一、荧光现象一些化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光指的是当一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻发光，停止能量供给，发光瞬间即停止的一种发光。荧光产生的原理：荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光能量后，分子呈激发态而极不稳定，当其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，这种幅射现象称为发光。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光。而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学反应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。二、荧光物质（一）荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：1.异硫氰酸荧光素（FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感；通常切片标本中的绿色荧光少于红色。2.四乙基罗丹明（RB200）：为橘红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最大吸收光波长为570nm，最大发射光波长为595600nm，呈橘红色荧光。2563.四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）：最大吸引光波长为550nm，最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氰基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。4.藻红蛋白（R-RE）：本品为无定形，褐红色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸引光波长为565nm，最大发射光波长为578nm，呈明亮的橙色荧光。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，故被广泛用于对比染色或用于两种不同颜色的荧光抗体的双重染色。（二）其他荧光物质1.酶作用后产生荧光的物质：某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-D半乳糖苷，受-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯乙酸等。2.镧系螯合物：某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3+）、铽（Tb3+）、铈（Ce3+）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3+应用最广。Eu3+螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。三、荧光技术中有关的概念和参数发射光谱：指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。激发光谱：指固定检测发射波长，在不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。荧光效率：荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。荧光效率=发射荧光的光量分子数（荧光强度）吸收光的光量子数（激发光强度），发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长最接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波长在接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。荧光寿命：指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。荧光的猝灭：指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间照射后会发生减弱的现象。这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。第二节荧光抗体技术一、荧光抗体的制备（一）抗体的荧光素标记用于标记的抗体，要求是高特异性和高亲和力的。所用抗血清中不应含有针对标本中正常组织的抗体。一般需经纯化提取IgG后再作标记。作为标记的荧光素应符合以下要求：应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。常用的标记蛋白质的方法有搅拌法和透析法两种。以FITC（异硫氰酸荧光素）标记为例，搅拌标记法为：先将待标记的蛋白质溶液用0.5mlL pH9.0的碳酸盐缓冲液平衡，随后在磁力搅拌下逐滴加入FITC溶液，在室温持续搅拌46h后，离心，上清即为标记物。此法适用于标记体积较大，蛋白含量较高的抗体溶液。优点是标记时间短，荧光素用量少。但本法的影响因素多，若操作不当会引起较强的非特异性荧光染色。透析法适用于标记样品量少，蛋白含量低的抗体溶液。此法标记比较均匀，非特异染色也较低。方法为：先将待标记的蛋白质溶液装入透析袋中，置于含FITC （异硫氰酸荧光素）的0.01molL pH9.4碳酸盐缓冲液中反应过夜，以后再对PBS透析法去除游离色素。低速离心，取上清。标记完成后，还应对标记抗体进一步纯化以去除未结合的游离荧光素和过多结合荧光素的抗体。纯化方法可采用透析法或层析分离法。（二）荧光抗体的鉴定荧光抗体在使用前应加以鉴定。鉴定指标记包括效价及荧光素与蛋白质的结合比率。抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1：16者较为理想。荧光素与蛋白质结合比率（FP）的测定和计算的基本方法是：将制备的荧光抗体稀释至A28011.0，分别测读A280 （蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰，按公式计算。FP值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以FP=1.5为宜，用于活细胞染色的以FP=2.4为宜。抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1：41：256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。荧光抗体的保存应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，-20冻存，这样就可放置34年。在4中一般也可存放12年。二、免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术的基本原理是：使荧光抗体与标本切片中组织或细胞表面的抗原进行反应，洗涤除去游离的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光。（一）标本的制作荧光显微技术主要靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果作为抗原的鉴定和定位。因此标本制作的好坏直接影响到检测的结果。在制作标本过程中应力求保持抗原的完整性，并在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解和变性，也不扩散至邻近细胞或组织间隙中去。标本切片要求尽量薄些，以利抗原抗体接触和镜检。标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，有传染性的标本要注意安全。常见的临床标本主要有组织、细胞和细菌三大类。按不同标本可制作涂片、印片或切片。组织材料可制备成石蜡切片或冷冻切片。石蜡切片因操作烦琐，结果不稳定，非特异反应强等已少应用。组织标本也可制成印片，方法是用洗净的玻片轻压组织切面，使玻片粘上12层组织细胞。细胞或细菌可制成涂片，涂片应薄而均匀。涂片或印片制成后应迅速吹干、封装。置-10保存或立即使用。（二）荧光抗体染色于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体。置湿盒内，在一定温度下温育一定时间，一般可用2537，30min，不耐热抗原的检测则以4过夜为宜。用PBS充分洗涤，干燥。（三）荧光显微镜检查经荧光抗体染色的标本，需要在荧光显微镜下观察。最好在染色当天即作镜检，以防荧光消退，影响结果。荧光显微镜检查应在通风良好的暗室内进行。首先要选择好光源或滤光片。滤光片的正确选择是获得良好荧光观察效果的重要条件。在光源前面的一组激发滤光片，其作用是提供合适的激发光。激发滤光片有两种。MG为紫外光滤片，只允许波长275400nm的紫外光通过，最大透光度在365nm；BG为蓝紫外光滤片，只允许波长325500nm的蓝外光通过，最大透光度为410nm。靠近目镜的一组阻挡滤光片（又称吸收滤光片或抑制滤光片）的作用是滤除激发光，只允许荧光通过。透光范围为410650nm，代号有OG（橙黄色）和GG（淡绿黄色）两种。观察FITC标记物可选用激发滤光片BG12，配以吸收滤光片OG4或GG9。观察RB200标记物时，可选用BG12与OG5配合。（四）实验的类型1.直接法：用特异荧光抗体直接滴加于标本上，使之与抗原发生特异性结合。本法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物）2.间接法：可用于检测抗原和抗体。本法有两种抗体相继作用，第一抗体为针对抗原的特异抗体，第二抗体（荧光抗体）为针对第一抗体的抗抗体。本法灵敏度高，而且在不同抗原的检测中只需应用一种荧光抗体。说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物）3.补体结合法：本法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体（多用豚鼠补体），再用荧光标记的抗补体抗体进行示踪。本法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。4.双标记法：本法用FITC及罗丹明分别标记不同的抗体，而对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到橙红和黄绿两种荧光色泽。说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此处仅为授课之用，不作为出版物）第三节荧光免疫测定（详见第二十三章）习题48 荧光效率是指A.荧光色素将吸收的光能转变为荧光的百分率B.荧光色素产生荧光的强度C.接受激光后，荧光物质所产生的荧光色调D.特异性荧光和非特异性荧光的强度比E.物质产生荧光的效率答疑编号500734090101正确答案A（49-50共用题干）A.直接法B.间接法C.补体结合法D.双标记法E.混合法习题49 荧光抗体染色技术中，只制备一种标记抗体，却可检测几乎所有抗原抗体的系统是答疑编号500734090102正确答案B习题50 荧光抗体染色技术中，特异性最高，非特异性染色最低的方法是答疑编号500734090103正确答案A习题51 作为荧光抗体标记的荧光素所具备的条件中，与提高观察效果有关的因素是A.具有化学上的活性基团能与蛋白稳定结合B.性质稳定不影响抗体活性C.荧光效率高，荧光与背景组织色泽对比鲜明D.与蛋白质结合的方法简便迅速E.与蛋白质的结合物稳定答疑编号500734090104正确答案C第十章酶免疫技术本章考点1.酶免疫技术的特点2.酶免疫技术分类3.酶联免疫吸附试验（ELISA）4.膜载体的酶免疫测定5.临床应用第一节酶免疫技术的特点 酶免疫技术是利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原-抗体免疫学反应检测敏感性的一种标记免疫技术。该技术所用的酶要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格不贵、制备成的酶标抗体或抗原性质稳定，继续保留着它的活性部分和催化能力。最好在受检标本中不存在与标记酶相同的酶。另外它的相应底物应易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定，光吸收高。一、酶和酶作用的底物 1.辣根过氧化酶（HRP）：HRP在蔬菜作物辣根中含量很高，纯化方法也不复杂。它是一种糖蛋白，含糖量约l8%；分子量为44kD；是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成的一种卟啉蛋白质。主酶为无色糖蛋白，在275nm波长处有最高吸收峰；辅基是深棕色的含铁卟啉环，在403nm波长处有最高吸收峰。HRP对受氢体的专一性很高，除H202外，仅作用于小分子醇的过氧化物和尿素的过氧化物。后者为固体，作为试剂较H202方便。许多化合物可作为HRP的供氧体，在ELISA中常用的供氢体底物为邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）和ABTS。OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便。其缺点是配成应用液后稳定性差，而且具有致异变性。TMB无此缺点。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明；加酸停止酶反应后变黄色，可在比色计中定量；因此应用日见增多。ABTS，虽然灵敏度不如0PD和TMB，但空白值很低。2.碱性磷酸酶（AP）：是从牛肠粘膜或大肠杆菌中提取。从大肠杆菌提取的AP分子量为80kD，酶作用的最适pH为8.0；用小牛肠黏膜提取的AP分子量为l00kD，最适pH为9.6。一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物。它可制成片状试剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。在ELISA中应用AP系统，其敏感性一般高于应用HRP系统，空白值也较低。但由于AP较难得到高纯度制剂，稳定性较HRP低，价格较HRP高，制备酶结合物时得率较HRP低等原因，国内在ELISA中一般均采用HRP。3.其他的酶：有葡萄糖氧化酶、-半乳糖苷酶和脲酶等。-半乳糖苷酸的底物常用4-甲基伞基-半乳糖苷，经酶水解后产生荧光物质4-甲基伞酮，可用荧光计检测。荧光的放大作用大大提高了方法的敏感度。AP也可应用可产生荧光的伞基磷酸酯作底物。其缺点是需要荧光计测定，而且如用固相载体直接作为测定容器，此载体不可发出荧光。脲酶的特点是酶作用后反应液发生pH改变，可使指示剂变色；另外，在人体内没有内源酶。二、酶标记抗体或抗原酶标记的抗原或抗体称为结合物（conjugate）。抗原由于化学结构不同，可用不同的方法与酶结合，如为蛋白质抗原，基本上可参考抗体酶标记的方法。制备抗体酶结合物的方法通常有以下几种。1.戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过它而偶联。戊二醛交联可用一步法（如连接AP），也可用二步法（如连接HRP）。戊二醛一步法操作简便、有效，而且重复性好。缺点是交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。制备HRP抗体结合物也可用二步法，即先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。此法的效率可高于一步法l0倍左右。2.过碘酸盐氧化法：本法只用于HRP的交联。该酶含18%碳水化合物，过碘酸盐将其分子表面的多糖氧化为醛基。用硼氢化钠（NaBH4）中和多余的过碘酸。酶上的醛根很活泼，可与蛋白质结合，形成按摩尔比例结合的酶标结合物。有人认为此法为辣根过氧化物酶交联最有效的方法。但也有只认为由于所用试剂较为剧烈，各批实验结果不易重复。按以上方法制备的结合物一般混有未结合的酶和抗体。理论上结合物中混有游离酶不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过洗涤，非特异性吸附于固相上的游离酶已被洗去。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因而减低结合到固相上的酶标抗体量。因此制备的结合物应予以纯化。纯化的方法较多，分离大分子混合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法操作简便，但效果不如用sephadexg-200凝胶过滤的好。3.标记抗体鉴定：通常采用棋盘滴定法进行筛选，见第十九章。三、固相载体酶免疫技术的主要试剂为固相的抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体和与标记酶直接关联的酶反应底物。可作固相载体的物质很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后保留原来的免疫活性。聚苯乙烯为塑料，可制成各种形式，在测定过程中，它作为载体和容器，不参与化学反应，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯载体的形状主要有三种：小试管、小珠和微量反应板。小试管的特点是还能兼作反应的容器，最后放入分光光度计中比色。小珠一般为直径0.6cm的圆球，表面经磨砂处理后吸附面积大增加。如用特殊的洗涤器，在洗涤过程中使圆珠滚动淋洗，效果更好。最常用的载体为微量反应板，专用于ELISA测定的产品也称为ELISA板，国际通用的标准板形是812的96孔式。为便于作少量标本的检测，有制成8联或l2联孔条的，放入座架后，大小与标准ELISA板相同。ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在特定的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量反应板型的ELISA检测，包括加样、洗涤、保温、比色等步骤，对操作的标准化极为有利。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间和同一板各孔之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于配料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大。因此每一批号的聚苯乙烯制品在使用前须检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ngml）包被ELISA板各孔后，每孔内加入适当稀释的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各读数在0.8左右。计算所有读数的平均值。所有单个读数与平均读数之差应小于10%。与聚苯乙烯类似的塑料为聚氯乙烯。作为ELISA固相载体，聚氯乙烯板的特点为质软板薄，可切割，价廉、但光洁度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有时也略高。为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣，可用以下方法加以检验：用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和一个典型的阴性标本。将它们分别进行一系列稀释后，在不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定，然后比较测定结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果判别最大，这种载体就是这一ELISA测定的最合适的固相载体。除塑料制品外，固相酶免疫测定的载体还有两种材料：一是微孔滤膜，如硝酸纤维素膜、尼龙膜等，这类测定形式将在本章“膜载体的酶免疫测定”中介绍。另一种载体是以含铁的磁性微粒制作的，反应时固相微粒悬浮在溶液中，具有液相反应的速率，反应结束后用磁铁吸引作为分离的手段，洗涤也十分方便，但需配备特殊的仪器。四、免疫吸附剂固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被。由于载体的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯ELISA板为载体，通常将抗原或抗体溶于缓冲液（最常用的为pH9.6的碳酸缓冲液）中，加于ELISA板孔中在4过夜，经清洗后即可应用。如果包被液中的蛋白质浓度过低，固相载体表面有能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色而导致本底偏高。在这种情况下，如在包被后再用1%5%牛血清白蛋白包被一次，可以消除这种干扰。这一过程称为封闭（blocking）。包被好的ELISA板在低温可放置一段时间而不失去其免疫活性。第二节酶免疫技术的分类 酶免疫技术是以酶标记的抗体或抗原为主要试剂的方法，是标记免疫技术的一种。近年来标记免疫技术飞速发展，应用不同标记物，根据不同原理、不同技术建立起来的检测方法层出不穷，而方法的创建者往往给同类的方法以不同的名称。因此确知某一方法属于哪一类型，对该方法的正确理解有着重要意义。酶免疫技术是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即应用制备好的特异性抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。它的特点是具有高度的特异性和敏感性。如将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物-酶进行标记，则在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。这种酶标记免疫技术一般分为两类，一类用于组织切片或其他标本中抗原或抗体的定位，另一类用于液体标本中抗原或抗体的测定。前者属于酶免疫组化技术范畴，后者则称为酶免疫测定（EIA）。酶用作免疫技术标记物是从抗原定位开始的。1966年Nakene和Pierce利用酶使底物显色的作用而得到与荧光抗体技术相似的结果。20世纪70年代初，酶标抗体技术开始应用于免疫测定，其后得到迅速发展。酶免疫技术一般分成酶免疫组化技术和酶免疫测定两大类。酶免疫组化技术与荧光抗体技术相似，酶标记抗体与组织切片上的抗原起反应，然后与酶底物作用，形成有色沉淀物，可以在普通光学显微镜下观察。如酶作用的产物电子密度发生一定的改变.则可用电子显微镜观察，称为酶免疫电镜技术。酶免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的酶标记物而分为均相（homogenous）和异相（heterogenous）两种类型，实际上所有的标记免疫测定均可分成这两类。如以标记抗体检测标本中的抗原为例，按照简单的形式是在试剂抗体过量的情况下进行，其反应式如下： Ab*+AgAb*Ag+Ab*Ab*Ag代表结合的标记物，Ab*为游离的标记物。如在抗原反应后，先把Ab*Ag与Ab*分离，然后测定Ab*Ag或Ab*中的标记物的量，从而推算出标本中的抗原量，这种方法称为异相法。如在抗原抗体反应后Ab*Ag中的标记物Ab*失去其特性，例如酶失去其活力，荧光物质不显荧光，则不需要进行Ab*Ag与Ab*的分离，可以直接测定游离的Ab*量，从而推算出标本中的Ag含量，这种方法称为均相法。在异相法中，抗原和抗体如在液体中反应，分离游离和结合的标记物的方法有好多种。与放射免疫测定相类似的液相酶免疫测定，在某些激素等定量测定中也有应用。但常用的酶免疫测定法为固相酶免疫测定。其特点是将抗原或抗体制成固相制剂，这样在与标本中抗体或抗原反应后，只需经过固相的洗涤，就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离，大大简化了操作步骤。这种被称为ELISA的检测技术成为目前临床检验中应用较广的免疫测定方法。综上所述，酶免疫技术的分类可概括如图4-10-1。一、均相酶免疫测定1.酶增强免疫测定技术（EMIT）：EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原，保留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。2.克隆酶供体免疫分析：DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如-D半乳糖苷酶）分子的两个片段.大片段称为酶受体（EA），小分子称作酶供体（ED），两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法，测定原理为：标本中的抗原和酶供体（ED）标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体（EA）结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。二、异相酶免疫测定异相酶免疫测定是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术。依据测定方法是否采用固相材料以吸附抗原或抗体，又分为液相和固相酶免疫测定两类：1.液相酶免疫测定：其测定灵敏度与放射免疫方法相近，近年有取代放射免疫方法的趋势。2.固相酶免疫测定：如常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）。第三节酶联免疫吸附试验 一、基本原理 酶联免疫吸附实验（ELISA）属固相酶免疫测定方法，其基本原理：在固相载体（如聚苯乙烯反应板）上包被抗原或抗体后，通过抗原抗体反应使酶标抗体（或酶标抗原）结合到载体上，经洗涤使结合的酶标抗体和游离的酶标抗体分离，洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原），加入底物显色，根据颜色深浅进行定性或定量分析。二、方法类型及反应原理ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。（二）双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。（三）间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体问接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。 （四）竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。操作步骤如下：（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。（3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（五）捕获法测IgM抗体血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法，先将所有血清IgM（包括特异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。（六）应用亲和素和生物素的ELISA亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。生物素又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶结合物，以放大反应信号。说明：此辅导中图片均引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社，1995年9月第1版第4次印刷（版权归原作者，此初仅为授课之用，不作为出版物）第四节膜载体的酶免疫测定 一、斑点-ELISA斑点-ELISA（dot-ELISA）的特点时：以吸附蛋白质能力很强的硝酸纤维素膜为固相载体；底物经酶反应后形成有色沉淀，使固相膜染色。在实验室中斑点-ELISA可按下法进行。在硝酸纤维膜上用铅笔划成4mm4mm的小格，在每格中央点加抗原12l，成为一个小点。干燥后将每格剪下分别放入ELISA板孔中，按ELISA方法操作，最后加入能形成不溶性有色沉淀的底物，如在膜上出现染色斑点，即为阳性反应（图4-10-2）。因硝酸纤维素膜吸附性能强，一般在包被后须再进行封闭。如将硝酸纤维素膜裁剪成膜条，并在同一张膜条上点有多种抗原，将整个膜条与同一份血清反应，则可同时获得对多种疾病的诊断结果。斑点-ELISA的缺点是操作麻烦，特别是洗涤的操作很不方便。应用斑点-ELISA的原理，通过特殊工艺已制备出各种试剂，供临床检验用。一般分三种类型：将试剂膜粘贴在塑料条片，便于洗涤和观察。将试剂膜封在小盒内，膜下垫吸水剂，洗涤液通过膜吸入盒内。此即斑点免疫渗滤试验。将试剂膜固定在小杠框格中放入特殊的自动分析仪中检测。应用这一系统可做各种蛋白质、激素、药物和抗生素的定量测定。二、免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法Southern blot相类似，亦被称为Western blot。免疫印迹法（图4-10-3）分三个阶段进行。第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯胺凝胶中从阴极向阳泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（1OOV）和大电流（12A），通电45min转移即可完成。此分阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-l-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE加入的分子量标准，确定各组分的分子量。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒可方便地在实验室中供检测用。根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。三、斑点免疫渗滤试验以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性，使抗原抗体反应和洗涤在一特殊的渗滤装置上，以液体渗滤过膜的方式迅速完成。本法的质量控制常采用在硝酸纤维素膜上点加质控点的方法。质控小圆点多位于反应斑点的正下方。双抗体夹心法的质控点最好是相应抗原，若该抗原试剂不易制备或价格昂贵时，也可用SPA或针对金标抗体的抗抗体充当；间接法的质控点采用盐析法粗提的人IgG最为经济、方便。斑点免疫层析试验以硝酸纤维素为载体，利用微孔滤膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一般。第五节酶免疫测定的应用 酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用以检测。它的最小可测值达ng甚至pg水平。与放射免疫分析相比，酶免疫测定的优点是标记试剂比较稳定，且无放射性危害。因此，酶免疫测定的应用日新月异，酶免疫测定的新方法、新技术不断发展。但酶免疫测定在医学检验中的普及应归功于商品试剂盒和自动或半自动检测仪器的问世。酶免疫测定步骤复杂，试剂制备困难。只有用符合要求的试剂和标准化的操作，才能获得满意的结果。商品ELISA试剂盒中应包含包被好的固相载体、酶结合物底物和洗涤液等。先进的试剂盒不仅提供全部试剂成分，而且所有试剂均已配制成应用液，并在各种试剂中加色素，使之呈现不同的颜色。ELISA操作步骤多，所需试剂也多，这种有色试剂既方便操作又有利于减少操作错误。ELISA所有仪器除定量测定中必需的出色仪（专用的称为ELISA测读仪）外，洗涤板也极有用。洗涤机的使用不仅省时省工，而且也利于操作标准化，对中小型实验室是实用且易于接受的。但应注意在采用洗板机前，应先对洗板机的性能加以检定，确认各孔的洗涤效果是否彻底，且重复性好。半自动和自动化ELISA分析仪亦趋成熟，并在大中型临床检验实验室中取得应