托吡酯对发育期癫痫大鼠学习记忆能力及海马组织GAP 43表达的影响.doc

托吡酯对发育期癫痫大鼠学习记忆能力及海马组织GAP 43表达的影响【摘要】目的研究托吡酯(TPM)对戊四氮(PTZ)致癫痫的发育期大鼠学习记忆能力及海马组织神经生长相关蛋白（GAP43)表达的影响。方法从80只6周龄健康雄性SD大鼠中随机抽取16只作为正常对照组；余64只以PTZ腹腔注射,制作癫痫持续状态（SE）模型，再随机分为模型对照组、TPM低剂量组、TPM中剂量组和TPM高剂量组,每组16只。TPM低、中、高剂量组分别给予TPM 20、40和80 mgkg- 1灌胃。2周后应用Morris水迷宫、Y迷宫评价大鼠的学习记忆能力，应用RTPCR 方法检测大鼠海马组织GAP43mRNA表达变化。结果发育期癫痫大鼠的学习记忆能力较正常大鼠明显下降（P0.05），海马组织GAP43mRNA相对吸光度值降低（P0.05）。癫痫大鼠学习记忆能力经低、中剂量TPM干预后未发生明显变化，海马组织GAP43mRNA相对吸光度值也无明显变化；经高剂量TPM干预后学习记忆能力则明显下降（P0.05），海马组织GAP43mRNA相对吸光度值降低（P0.05）。结论SE后发育期大鼠的学习记忆能力受损，大剂量应用TPM可加重这一损害，该损害可能与调节海马GAP43表达有关。 【关键词】 癫痫 戊四氮 海马 托吡酯 学习记忆 神经生长相关蛋白Effect of topiramate on ability of learning and memory and expression ofhippocampal GAP 43mRNA in developmental status epilepticus ratsLI Yan,TANG Hong li,LUO Ping xiang(Department of Pediatrics,Zhongda Hospital,Southeast University,Nanjing 210009,China）Abstract:Objective To investigate the effect of topiramate on ability of learning and memory and the content of neuronalgrowth associated protein 43 （GAP 43） activity in hippocampus of pentetazole (PTZ) induced epileptic rats.Methods Sixteen of eighty immature healthy male SD rats were assigned normal control group randomly,sixty four were made developmental status epilepticus (SE)model by topiramate (TPM) and randomly divided into 4 equal groups:the model control group,TPM small dose group,TPM middle dose group,TPM large dose group.Dose of TPM 20,40 and 80mg.kg-1 were given respectively for two weeks.The ability of learning and memory was tested by Morris water maze and Y maze.The expression of GAP 43mRNA in hippocampus was detected by reverse transcription polymerase chain reaction.Results Compared with the normal group,learning and memory dysfunction were observed in epileptic rats(P0.05),relative absorbance of GAP 43mRNA decreased significantly(P0.05).Compared with the model group,TPM small and middle dose groups showed no different in learning and memory function and relative absorbance of GAP 43mRNA,but TPM large dose appeared to impair the learning and memory function (P0.05) and relative absorbance of GAP 43mRNA decreased significantly(P0.05).Conclusion SE can damages ability of learning and memory in immature rats.Large dose TPM appears to aggravate the learning and memory function of epileptic rats,which might be relevant to its regulating effect on the expression of GAP 43 in hippocampus.Key words:epilepsy;pentylenetetrazol;hippocampus;topiramate;learning and memory；neuronalgrowth associated protein 43（Modern Medical Journal,2008,36:381 384）癫痫是一组由大脑神经元异常同步放电引起的以短暂性中枢神经系统功能失常为特征的慢性脑部疾病。众多研究发现,癫痫后存在不同程度学习记忆等认知功能的损害，尤其是在癫痫患儿中。托吡酯TPM，商品名为妥泰(Topamax)是一种新型抗癫痫药物,在临床上已得到广泛的应用,其对认知功能的影响也越来越引起人们的关注。本实验应用戊四氮(pentylenetetrazole，PTZ)建立发育期大鼠癫痫持续状态（SE）模型，观察不同剂量TPM对大鼠学习记忆能力及海马组织神经生长相关蛋白43(neuronalgrowth associated protein,GAP 43)表达的影响，以探讨TPM对癫痫大鼠学习记忆功能的影响及其可能机制。1 材料与方法1.1 实验动物6周龄健康清洁级雄性SD大鼠(东南大学医学院实验动物中心提供)80只,实验起始体重(11020)g,12h光亮/黑暗条件、2225环境温度下混合喂养。1.2 试剂戊四氮(美国Sigma公司),TPM（西安杨森制药有限公司,生产批号:060215,25mg.片-1)；设计合成的扩增GAP 43的cDNA 引物（由上海生物工程公司合成），上游引物:5′ ACAAGGAAAAAGCTCAAAG 3′,下游引物:5′ GACGGGGAGTTATCAGTGG 3′；RNA 提取试剂Trizol（美国Invitrogen公司），逆转录试剂盒（美国Promega公司），Taq 酶（日本Takara公司），大鼠Morris水迷宫(中国药科大学),Y迷宫(张家港市三兴教学仪器厂) 。1.3 动物分组及模型建立1.3.1 分组 在80只大鼠中随机抽取16只作为正常对照组；余64只制作成SE模型，依据TPM使用剂量进一步分为低、中、高剂量组及模型对照组（均n=16）。1.3.2 动物模型建立 PTZ 20mg.kg- 1大鼠腹腔注射,然后每10min注射10mg.kg-1,直至达到SE发作。癫痫发作标准1:级——点头、眨眼、颈动或湿狗样颤抖；级——节律性点头；级——头部抽搐加前肢颤抖；级——第级加后肢站立；级——惊厥致跌倒,全身强直性抽搐。、级发作持续30min及以上者为SE。 造模成功后12h,TPM低、中、高剂量组分别给予TPM 20、40、80mg.kg-1灌胃，模型对照组和正常对照组予以等体积生理盐水灌胃。每隔24h重复给等量药1次,持续2周。各组动物混合饲养,每日测其体重以调整灌胃剂量。2周给药结束后开始进行行为学测试。1.4 行为学测试1.4.1 Morris水迷宫实验2 (1)定位航行实验：历时4d,每天8次,将大鼠从4个入水点面向池壁放入水中,记录120 s内寻找平台的时间(逃避潜伏期) 。找到平台后休息20s,如果120s内找不到平台,则逃避潜伏期计为2min,并帮助其上平台休息,再按顺序由下一象限入水进行下一次实验。取8次的平均值进行统计。(2)空间探索实验：定位航行试验结束后撤除平台,然后将大鼠任选一入水点放入水中,测其120s 内在原放有平台的象限内停留的时间(探索正确时间)。1.4.2 Y迷宫 参照文献3进行检测。大鼠10s内从非安全区一次性跑到安全区为正确反应,否则为错误反应。连续10次有9次正确为达到学会标准,记录达标所需训练次数。24h 后以同样方法测试,每只大鼠进行10次,正确率即为24h记忆保持率。1.5 海马组织GAP 43mRNA的RT PCR检测大鼠Morris水迷宫实验完毕后，每组随机选取大鼠8只，直接断头取双侧海马,生理盐水冲洗后，置-80 冰箱中保存。采用Trizol一步法提取总RNA。按试剂盒说明书进行操作,PCR反应条件:94预变性5min；94变性45s，55（以引物序列后退火温度为主）复性 45s，72延伸1min；循环35次，72延伸10min。取10μl 扩增产物与2μl 6×loading缓冲液混合后，在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，用ImageMaster VDS图像分析处理系统扫描，以ODGAP 43/ODβ actin cDNA吸光度比值作为GAP 43mRNA 的相对表达水平。1.6 统计学处理数据以x-s表示，采用SPSS13.0软件进行t检验和方差分析。2 结 果2.1 Morris水迷宫实验大鼠定位航行实验结果显示,与正常对照组相比,模型对照组大鼠到达平台的平均逃避潜伏期均明显延长（P0.05）；高剂量组与模型对照组相比,到达平台的平均逃避潜伏期明显延长(P0.05)。空间探索实验结果则显示:大鼠120 s内在原放有平台的象限内停留的时间模型对照组与正常对照组比较差异有统计学意义（P0.05）,高剂量组明显减少(P0.05,表1）。 表1 托吡酯对大鼠水迷宫实验的影响 与正常对照组比较，*P0.05；与模型对照组比较，P0.052.2 Y迷宫实验与正常对照组比较,其余各组大鼠学会达标所需训练次数增多,24 h 记忆保持率均有不同程度下降,差异均有统计学意义；TPM低剂量、中剂量组与模型对照组无明显差异，高剂量组与模型对照组相比，学会达标所需训练次数增多,24 h 记忆保持率下降,差异有统计学意义（P0.05,表2）。表2 托吡酯对大鼠Y迷宫实验的影响与正常对照组比较，*P0.05；与模型对照组比较，P0.052.3 大鼠海马组织GAP 43mRNA表达经治疗后,TMP各组大鼠海马组织GAP 43mRNA 相对吸光度值较正常对照组均降低(P0.05)；低剂量、中剂量组与模型对照组比较差异无统计学意义， 高剂量组较模型对照组明显降低（表3,图1）。3 讨 论PTZ是一种氨基酸（GABAA）受体的拮抗剂,其本表3 各组大鼠海马组织GAP 43mRNA相对吸光度值比较身不破坏脑组织结构,无特殊的神经毒性作用,对大鼠的记忆、视力和运动能力无明显影响,采用PTZ制作的SE模型是一种与人类癫痫具有高度相似性的慢性癫痫模型。Morris水迷宫和Y迷宫实验是研究与海马功能直接相关的空间学习记忆的方法,可客观反映动物的空间学习记忆能力。本实验结果显示,在Morris水迷宫中,与正常对照组比较,模型对照组大鼠平均逃避潜伏期显著延长,原平台所在象限停留时间明显缩短；在Y迷宫实验中,模型对照组大鼠达到学会所需的训练次数较正常对照组大鼠增多,24 h记忆保持率较正常对照组大鼠低，证明本实验中SE模型大鼠的学习记忆能力受到了损害。TPM具有多种抗癫痫机制，对多种类型癫痫尤其是难治性癫痫临床疗效肯定。随着TPM在临床上的应用，其中枢神经系统的不良反应，尤其是对患者认知功能的损害引起了广泛的关注，有关TPM影响认知功能的报道也较多。Smith等4研究发现，TPM可对正常人工作记忆产生损害，服用TPM后受试者脑电图和诱发电位的改变与工作记忆损害程度相一致。有学者5认为，TPM引起的认知障碍随着药物剂量的加大、添加速度过快及多药治疗而增加；但也有研究6认为，认知障碍与TPM的剂量和血药浓度无关，部分患者即使是缓慢加量、给予适当的剂量仍有明显的认知障碍，可能与个体的敏感性有关，TPM剂量不能衡量TPM引起的认知障碍的程度。本实验中我们发现，TPM治疗与认知功能障碍之间存在一定的剂量关系，低剂量(20mg.kg-1)、中剂量（40mg.kg-1）对学习记忆的影响不明显，高剂量（80mg.kg-1）明显抑制了癫痫大鼠的学习记忆能力。此结果对TPM的临床应用具有一定的参考价值。学习记忆是一个复杂的过程，现已知道,海马是学习记忆的关键部位,突触可塑性(synaptic plasticity)是学习记忆的神经基础,长时程增强(long term potentiation,LTP) 是突触可塑性的典型表现7。突触可塑性是指突触形成、结构及其功能(主要是信号强度) 具有可调节性。GAP 43是一种神经元特异性胞膜磷酸蛋白，主要分布于轴突生长锥质膜和突触前末端，与神经系统生长发育、再生、轴突生长和突触重组密切相关，被作为突触生长的标志物,对突触可塑性具有重要意义。GAP 43在边缘系统和联络区有丰富表达,表明它与长期记忆相关的可塑性有关8。GAP 43和PKC基因的过表达将明显增强转基因鼠的长时程电位(LTP) 和学习能力,因LTP与记忆有关,表明GAP 43 基因与学习、记忆的调节有关9。由LTP所引发的突触效能的变化可影响GAP 43mRNA 的表达10。本研究显示,癫痫反复发作大鼠学习记忆功能降低的同时,海马组织中GAP 43转录水平下调,低、中剂量治疗后癫痫模型大鼠学习记忆能力无明显改善,GAP 43转录水平与模型对照组无明显差异,高剂量治疗后癫痫模型大鼠学习记忆能力降低,同时GAP 43转录水平下调，表明高剂量TPM对癫痫模型大鼠学习记忆能力有损害作用,可能与调节GAP 43转录水平有关。综上所述,癫痫发作对认知能力存在损害，机制之一可能与大鼠海马内GAP 43转录水平下调有关。TPM可能通过调节海马内GAP 43转录水平引起癫痫大鼠认知能力损害，其损害程度可能与TPM的使用剂量有关。【参考文献】 1张莉,徐利军,池志宏,等.锂匹罗卡品致颞叶癫小鼠模型的建立及苔藓纤维出芽的实验研究J.解剖科学进展,2007,13(2):158160.2洪良利,田东萍,苏敏,等.低硒对F344纯系大鼠子代神经行为发育和学习记忆能力的影响J.卫生研究,2006,35(1):5458.3王秀利,唐洪丽,索国玲.癫持续状态对发育期大鼠学习记忆及海马磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白表达的影响J.实用儿科临床杂志,2007,22(22):17231725.4Smith M E,Gevins A,Mc Evoy L K,et al.Distinct cognitive neurophysiologic profiles for lamotrigine and topiramateJ.Epilepsia,2006,47(4):695703.5PrezAlvarez F,TimonedaGallart C,BausRosell J.Topiramate and epilepsy in the light of DasNaglieri Cognitive Assessment SystemJ.Rev Neurol,2006,42(1):37.6Gualtieri C T,Johnson L G.Comparative neurocognitive effects of 5 psychotropic anticonvulsants 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