测酶活方法.doc

本发明提供了一种利用二甲酚橙琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法：用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径为410mm的小孔,然后往小孔中加入待测液,室温静置20100min,测定紫红色圈的直径,根据过氧化氢浓度对数值与紫红色圈直径制作的标准直线来确定待测液中过氧化氢的浓度,从而确定L-氨基酸氧化酶的活力；所述待测液是以L-氨基酸氧化酶待测酶液为酶源,以0.220mmol/L的L-亮氨酸为底物,2550,pH59条件下反应0.52h后产生过氧化氢,获得的反应液经稀释后即为待测液；本发明方法具有灵敏度极高、成本低、操作简单方便、稳定性好、适用性广和环境友好等特点。 一种利用二甲酚橙琼脂平板定量检测L?氨基酸氧化酶活力的方法,所述方法包括：(1)二甲酚橙琼脂平板的制备：以水为溶剂,配制含有0.050.4mmol/L?FeSO4、0.040.3mmol/L二甲酚橙和1530g/L琼脂的水溶液,煮沸溶解,倒平板,冷却凝固后制成二甲酚橙琼脂平板；(2)待测液的制备：以0.220mmol/L的L?亮氨酸为底物,加入含L?氨基酸氧化酶待测酶液作为酶源,于2550、pH59条件下反应0.52h,获得的反应液用水经稀释后即为待测液；(3)L?氨基酸氧化酶活力的测定：用打孔器在二甲酚橙琼脂平板上打出直径为410mm的小孔,然后往小孔中加入待测液,室温静置20100min后,测定紫红色圈的直径；(4)标准曲线绘制：配制梯度浓度的过氧化氢溶液,按照步骤(3)方法进行检测,以过氧化氢浓度为横坐标、紫红色圈直径为纵坐标,绘制标准曲线；(5)结果判定：根据待测液的紫红色圈直径,对照标准曲线,获得待测液中过氧化氢的浓度值,从而获得L?氨基酸氧化酶活力数据；L?氨基酸氧化酶活力的定义为：1L酶液作用底物浓度为10mmol/L的L?氨基酸1h后释放出1mmol/L过氧化氢即为1个酶活单位U。 本发明公开了一种利用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L-氨基酸氧化酶活力的方法：用打孔器在普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为410mm的小孔,然后将小孔中加入待测液,室温静置10300min,待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈,测定蓝色圈的直径,根据过氧化氢与蓝色圈直径制作的标准直线来确定过氧化氢释放量,从而推论得L-氨基酸氧化酶活力；所述待测液以交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas?sp.B3)发酵培养获得的酶为酶源,以L-氨基酸为底物,2550,pH为59条件下反应0.52h,获得的反应液即为待测液；本发明方法具有成本低,操作简单方便,适用性广,稳定性高等特点。 用普鲁士蓝琼脂平板定量检测L?氨基酸氧化酶活力的方法,其特征在于所述方法为：(1)普鲁士蓝琼脂平板的制备：将1030g/L氯化铁水溶液与1030g/L铁氰化钾水溶液以体积比0.26:1混合制成混合液,然后将混合液与MM琼脂液以体积比1:520混合摇匀,在115下灭菌30min,倒平板,制成所述普鲁士蓝琼脂平板；所述MM琼脂液终浓度组成为：酵母膏010g/L、蛋白胨220g/L、琼脂1530g/L,pH?59,溶剂为水；(2)L?氨基酸氧化酶活力的测定：取步骤(1)制得的普鲁士蓝琼脂平板,用打孔器在所述普鲁士蓝琼脂平板上打出直径为410mm的小孔,然后将小孔中加入待测液,室温静置10300min,待测液产生的过氧化氢在所述的小孔周围形成蓝色圈,测定蓝色圈的直径,根据过氧化氢与蓝色圈直径标准直线来确定过氧化氢释放量,从而推论得L?氨基酸氧化酶活力；所述的过氧化氢与蓝色圈直径的标准直线是以所取用步骤(2)同样的普鲁士蓝琼脂平板以梯度浓度的标准过氧化氢为测试样品做与待测液平行试验取得的数据得到的标准浓度的过氧化氢与蓝色圈直径线性关系图；所述待测液的制备方法为：以交替假单胞菌B3(Pseudoalteromonas?sp.B3)发酵培养获得的酶为酶源,以待测L?氨基酸为底物,2550,pH?59条件下反应0.52h,获得的反应液即为待测液；所述酶来自于交替假单胞菌B3发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心弃去沉淀后获得的上清液,所述L?氨基酸初始底物浓度为220mmol/L,所述上清液用量以含湿菌体发酵液中湿菌体质量计为0