超声波协同酶法提取黑木耳多糖.docx

食品工业工艺技术超声波协同酶法提取黑木耳多糖娄在祥 1 ,张有林 2 ,王洪新 11. 江南大学食品学院 (无锡 214036) ; 2. 陕西师范大学(西安 710062)摘要 研究了黑木耳多糖的不同提取方法 。结果表明 ,超声波协同复合酶法可显著提高黑木耳多糖的提取率 ; 对其工艺进行了优化 , 其最佳提取条件为 : 料液比1 50 ,浸提时间215 h ,浸提温度80 ,超声波功率125 W , 超声波复合酶作用时间60 mi n , 作用温度50 , 纤维素酶用量390 U/ g , 中性蛋白酶用量650 U/ g ,黑木耳多糖提取率10141 % 。关键词 黑木耳多糖 ;超声波 ;纤维素酶 ;中性蛋白酶 ;提取Stu dy o n Extra ctio n of Auricula ria Polys a cch a ride with Enz ymatic Hydrolysis un de r Ultra so nic Wa ve Lo u Zai2xia ng 1 , Zha ng Yo u2lin 2 ,Wa n g Ho n g2xin 1( Wuxi 214036)1. School of Food Science and Technology ,Southern Yangtze University( Xian 710062)2. Shanxi Normal UniversityThe re2AbstractDifferent technologies for extraction of auricularia polysaccharide were studied i n this paper.sults showed that the extracti ng rate could be i ncreased by ultrasonic wave complex enzymatic technology.Thebest technological conditions for the extraction were as follows : the ratio of material and water was 1 50 , ex2tracti ng for 2. 5 h at 80 , the complex enzyme consisted of protei nase and cellulase , and the amount of pro2tei nase and cellulase used was 650 U/ g and 390 U/ g with a reacti ng ti me of 60 mi n at 50 under ultrasonicThe extracti ng rate of polysaccharide was 10141 %.wave of 125 W.Key wordsauricularia polysaccharide ;ultrasonic wave ; cellulase ;protei nase ;extraction黑木耳是我国珍贵的药用和食用胶质真菌 ,多糖为黑木耳的重要活性成分 1 ,它具有抗凝血 、抗肿瘤 、 抗炎症等细胞保护作用 ,还具有降低血脂 、胆固醇 2 、 血液黏度 、抗血栓形成 、降低血糖 、抗糖尿病 、抗衰老等作用 3 ,4 。多糖常用的提取方法有热水浸提法 , 碱提取法 ,酶解提取法等 。传统黑木耳多糖提取采用水体系 , 木耳细胞粗大 、壁厚 ,多糖难以从胞内扩散出来 ,需要 多次浸提 ,操作时间长 ,收率低 。碱浸提法容易使部分多糖发生水解 ,破坏多糖的活性结构 、减少多糖得率 。试验采用超声波协同酶法 5 提取多糖 , 并与传统提取 方法进行比较 ,确定出提取黑木耳多糖的最佳工艺条件 ,为创建高效 、经济的多糖提取工艺提供参考 。1 材料与方法1. 1 材料与仪器1. 1. 1 材料 秦岭山区野生优质黑木耳 。1. 1. 2 试剂纤维素酶 ( 100 000 U/ g) : 国药集团化学试剂有限 公司 ; 中性蛋白酶 ( 10 000 U/ g) : 北京奥博星生物技术责任有限公司 ;其余试剂均为国产分析纯试剂 。1. 1. 3 仪器TDL - 4型 离 心 机 : 上 海 安 亭 科 学 仪 器 厂 ; KQ -250DB 型超声波清洗器 : 昆山市超声仪器有限公司 ; CHRISHT ALPHAL - 4型真空冷冻干燥机 :德国 。1. 2 实验方法1. 2. 1 黑木耳多糖提取工艺流程黑木耳干粉 酶解等处理 热水浸提 离心 减 压浓缩 95 %乙醇沉淀多糖 离心 复溶 加三氯乙 酸除蛋白 离心 取上清液定容 测定多糖提取率 减压浓缩 真空冷冻干燥 黑木耳多糖1. 2. 2 黑木耳多糖的提取方法1. 2. 2. 1 热水浸提法 61. 2. 2. 2 碱提取法 71. 2. 2. 3 复合酶解提取法 81. 2. 2. 4 超声波提取法 91. 2. 2. 5 超声波协同纤维素酶提取法1. 2. 2. 6 超声波协同中性蛋白酶提取法1. 2. 2. 7 超声波协同复合酶提取法 ( 以下简称超声波 复合酶法)黑木耳干粉按1 40 ( w/ v) 加水 , 待温度升至40 时 ,加入复合酶 ( 370 U/ g 纤维素酶和650 U/ g 中性蛋白 酶) , 在120 W 超声场中作用60 mi n ,升温至80 灭酶 ,食品工业2007 年第 1 期29 食品工业工艺技术并在此温度下恒温浸提2 h ,离心 、减压浓缩 ,加入三倍体积的95 %乙醇沉淀多糖 , 静置过夜 , 洗涤 。将多糖沉 淀复溶 ,加入5 %三氯乙酸溶液反复脱蛋白 、离心 、定容 。1. 2. 3超声波复合酶法提取黑木耳多糖工艺条件的 确定1. 2. 3. 1 超声波复合酶法单因素试验分别对超声波复合酶作用温度 、纤维素酶用量 、中 性蛋白酶用量 、超声波复合酶作用时间 、超声波强度 、 浸提时间进行单因素试验 ,测定多糖提取率 。1. 2. 3. 2 超声波复合酶法最佳工艺条件的确定在上述单因素试验的基础上 ,采用四因素三水平 L 9( 3 4) 正交试验确定超声波复合酶法最佳工艺条件 ,试 验因素水平见表1 。表1因素水平表在酶解的过程中 ,只有适宜的温度才有利于发挥酶的最大活力 , 产生良好的多糖提取效果 。试验选用43 、45 、48 、50 、53 五 种 温 度 提 取 黑 木 耳 多 糖 ,结果见图2 。由图2看出 ,50 时 ,复合酶产生的酶解 效果最好 , 在其他条件相同的情况下 , 多糖提取率最高 。温度低于或高于50 ,酶的水解效果都有所下降 。温度过低 ,酶的活力受到抑制 ,水解效果不佳 ; 温度过 高 ,易导致酶蛋白变性 ,水解效果亦变差 。因素水平超声波功率W酶解时间mi n酶解温度 料液比图2酶解温度对多糖提取率的影响2. 2. 2 纤维素酶用量试验选择230 U/ g、310 U/ g 、390 U/ g、470 U/ g 四种 纤维素酶用量提取多糖 ,结果见图3 。由图3看出 ,当纤维素酶用量达到390 U/ g 时 ,多糖提取率的增长趋于平 缓 , 因此宜选择纤维素酶用量为390 U/ g。用量过大 ,不经济 ,纤维素酶还可能将多糖水解 ,引起多糖提取率下降 。1231001251505060704550551 401 501 601. 2. 4黑木耳多糖的测定及多糖提取率计算总糖测定采用苯酚 硫酸法 10 ,还原糖测定采用DSN 法 10 。多糖提取量 = 总糖量 - 还原糖量 。多糖提取 率 ( %) = ( 多糖提取量/ 黑木耳样品干重) 100 。1. 2. 5 黑木耳多糖干燥工艺取经过醇沉 、脱蛋白 、减压浓缩的多糖稠液 ,放入 真空冷冻干燥机干燥 。2 结果与分析2. 1 不同方法提取多糖提取率的比较 用设计中的七种提取方法提取黑木耳多糖 ,测定多糖提取率 ,结果见图1 。采用超声波复合酶提取法黑木耳多糖提取率达1031882 mg/ g , 在七种提取方法中 最高 。因此 ,选择超声波复合酶提取法提取黑木耳多糖为好 。图3纤维素酶用量对多糖提取率的影响中性蛋白酶用量分别选择150 U/ g 、400 U/ g 、650 U/ g 、900 U/ g 、1150 U/ g 五种中性蛋白酶用量提取黑木耳多糖 ,结果 见图 4 。由图 4 看出 ,当纤维素酶用量达到650 U/ g 时 ,多糖提取率最高 ,过高或过低时 ,多糖的提取率均有所下降 。1 热水浸提法2 碱提取法3 复合酶酶解提取法4 超声波提取法5 超声波纤维素酶提取法6 超声波中性蛋白酶提取法7 超声波复合酶提取法图4中性蛋白酶用量对多糖提取率的影响2. 2. 3 超声波酶作用时间 超声波酶作用时间是影响多糖提取率的关键因素 。选用40 mi n 、50 mi n 、60 mi n 、70 mi n 、80 mi n 五种作用时间试验 , 结果见图5 。图5看出 , 在功率为120 W 的超图1不同提取方法提取多糖提取率的比较2. 2 超声波复合酶法提取黑木耳多糖工艺条件的确定2. 2. 1 超声波酶作用温度食品工业2007 年第 1 期30 1994-2013 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 食品工业工艺技术声波作用下 , 复合酶酶解60 mi n , 多糖提取率最高 , 过长或过短都不利于多糖的提取 。果见表2 。表2超声波复合酶提取黑木耳多糖L 9( 3 4) 正交试验结果因素提取率 %ABC酶解温度/ D料液比试验号超声波功率 酶解作用/ w时间 / mi n1 ( 100)112 ( 125)223 ( 150)332. 4812. 5172. 5150. 8270. 8390. 8380. 01221 ( 50)2 ( 60)3 ( 70)1231232. 4822. 642. 3910. 8270. 880. 7970. 08321 ( 45)2 ( 50)3 ( 55)2313122. 4562. 5312. 5260. 8190. 8440. 8420. 02521 ( 1 40)2 ( 1 50)3 ( 1 60)3122312. 4192. 6392. 4550. 8060. 8800. 8180. 0732123456789K1K2K3 k 1 k 2 k 3R优水平7. 429. 347. 488. 048. 548. 128. 798. 397. 50图5超声波酶作用时间对多糖提取率的影响2. 2. 4 超声波功率超声波产生的强烈振动 、强烈的空化效应及搅拌 作用 ,可加速黑木耳多糖进入溶剂 ,提高多糖提取率 ,缩短提取时间 。超声波与酶协同作用 ,进一步强化酶的 水解效果 。超声波作用的对象是溶剂 、底物与复合酶 。在其它条件不变的情况下 ,一定范围内增大超声功率可提高水解速率 , 强化传质 , 破坏底物抗水解的稳定 性 。对水解底物 ,超声功率越大 ,细胞 、组织及一些晶体 结构破坏越彻底 ,越有利于多糖的提取 。但当超声功率过大时 ,因为超声波的剧烈刺激对酶的结构产生影响 ,酶活力开始下降 。因此 ,选择超声场强度要同时兼顾底 物和酶两种能量场的接受体 。本试验选用100 W、125W、150 W、175 W 的超声波功率提取黑木耳多糖 ,结果 见图6 。图6看出 , 超声波功率为125 W 时 , 酶解效果最好 ,多糖提取率最高 。表2极差分析表明 ,各个因素对黑木耳多糖的提取率均有不同程度的影响 ,各种因素对提取率影响的大 小顺序为 :B D C A ;超声波复合酶提取法提取黑 木耳多糖的最优水平组合为 A2B 2C2D2 。而由正交试验直 接 看 出 组 合 A1B 2C2D 2多 糖 提 取 率 最 高 。经 测 定 ,A2B 2C2D 2对应的多糖提取率大于 A1B 2C2D 2对应的多糖 提取率 ,因此确定超声波复合酶提取法提取多糖的最 优水平组合为 A2B 2C2D2 , 即超声波功率125 W , 超声波酶作用时间60 mi n ,作用温度50 ,料液比1 50 。2. 4 黑木耳多糖干品性状 得到的产品为灰白色絮团状固体 ,蓬松柔软 ,易溶于热水 ,在高浓度乙醇 、乙酸乙酯等有机溶剂中发生明 显醇析现象 。3 结论3. 1 超声波协同复合酶法提取黑木耳多糖的最佳工 艺条件为 : 料液比1 50 , 浸提时间215 h , 浸提温度80 , 超声波功率125 W , 超声波复合酶作用时间60 mi n ,作用温度50 , 纤维素酶用量390 U/ g , 中性蛋 白酶用量650 U/ g 。3. 2 与传统方法相比 ,采用超声波协同复合酶法提取黑木耳多糖