基因组dna提取教案.doc

学院检验学院系（教研室）病原生物与分子生物检验 教师姓名刘二强 课程名称临床微生物学与检验专业层次临床检验年级 授课方式实验讲授授课时间学时 授课题目： 人体外周血细胞基因组DNA的提取目的要求：掌握: 人体外周血细胞基因组DNA提取的原理和方法。重点难点：重点：试剂盒提取DNA的原理难点：人外周血基因组DNA酚抽提方法教具与课件： 板书 课外作业： 1复习人外周血细胞DNA分离与纯化酚抽提法的原理。2完成实验报告并对结果进行分析。课后回忆（经验教训、效果估计或反应，存在问题）： 系（教研室）主任 年 月 日教学内容与组织安排： 人体外周血细胞基因组DNA的分离与纯化【目的要求】 ： 1 掌握人血白细胞DNA分离与纯化的原理和方法。 【实验材料】 ： 血液基因组DNA提取试剂盒：细胞裂解液CL、缓冲液GS、 缓冲液GB、 缓冲液GD、漂洗液PW、 洗脱缓冲液TB、 Proteinase K 、吸附柱CB3、收集管 (2 ml)、 1.5 ml离心管 【实验内容】 ： 1 采用血液基因组DNA提取试剂盒利用酚抽提法提取人外周血细胞基因组DNA【实验原理】 ：酚抽提法提取DNA（1）分离提取DNA首先应分离出白细胞。将分散好的细胞用含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶的细胞裂解缓冲液进行裂解。EDTA为二价金属离子螯合剂，抑制DNA酶的活性使DNA完整的溶解在溶液中并降低细胞膜稳定性的作用。SDS作为生物阴离子去垢剂，在降解细胞膜、乳化脂质和蛋白质中起重要作用。无DNA酶的RNA酶通过有效水解RNA而避免DNA的消化。（2）随后加入蛋白酶K用于水解蛋白质，消化DNA酶及DNA上的蛋白质。（3）再用Tris酚反复抽提，因为酚作为蛋白质的变性剂，使蛋白质变性溶于有机相，DNA保留在水相。Tris缓冲液能确保抽提后的DNA进入水相，从而避免其滞留于蛋白质层。重复抽提有提高DNA的纯度的作用。一般抽提三次后，便可移出含DNA的水相，用于沉淀处理。（4）沉淀处理常以乙酸铵为沉淀用盐，用无水乙醇沉淀以去除残留的有机溶剂，并用70%的乙醇洗涤去盐，得到较纯净的基因组DNA。【实验方法】 ： 1. 处理血液材料（已添加抗凝剂的1 ml血液样品）：在样品中加入1-2.5倍体积的细胞裂解液CL，颠倒混匀，10,000 rpm离心1 min，吸去上清，留下细胞核沉淀，向离心收集到的细胞核沉淀中加200 l缓冲液GS，振荡至彻底混匀。加入4 l RNase A（100 mg/ml）溶液，振荡15 sec，室温放置5 min。 2. 加入20 l Proteinase K溶液，混匀。 3. 加200 l缓冲液GB，充分颠倒混匀，56放置10 min，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。 4. 加200 l 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。 5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 6. 向吸附柱CB3中加入500 l缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7. 向吸附柱CB3中加入600 l 漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm离心30 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8. 重复操作步骤7。 9. 12,000 rpm离心2 min，弃废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 10.将吸附柱CB3转入1.5 ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200 l 洗脱缓冲液TB，室温放置2-5 min，12,000 rpm离心2 min，将溶液收集到离心管中。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm离心2 min 11.DNA浓度及纯度检测 琼脂糖凝胶电泳核酸是两性电解质，其等电点为pH2.02.5左右，在常规的高于其等电点pH值的碱性缓冲溶液中带有负电荷，在电场中向正极移动。被分离的核酸分子在电场中的迁移率与凝胶浓度、被分离核酸分子的大小及构型、所加电压的高低、电泳缓冲液的组成及其离子强度等因素的影响。【实验结果】 ：【注意事项】 ： 1 对于高分子量DNA的制备，由于受剪切力的影响很大，每一步的操作都要特别小心、温和，避免激烈的吸取、振荡与混匀。 2 加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般37放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。如果裂解不彻底，需要延长裂解时间或重复裂解。 3 使用缓冲液GD、漂洗液PW前请先检查是否已加入无水乙醇。 4必须将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 5 洗脱缓冲液体积不应少于50 l，体积过小影响回收效率。 6酚的腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，应在化学通风橱中进行操作并且必须穿戴手套、防护镜及防护衣。与酚接触过的皮肤，应使用大量的水清