凝胶层析操作过程(莫雯静)

凝胶层析操作过程 莫雯静 凝胶层析即凝胶过滤技术 凝胶过滤技术主要包括 1 层析介质的选择 2 凝胶粒度的选择 3 凝胶用量的计算 4 凝胶的处理 5 柱的选择 6 装柱 7 流动相的选择 8 样液的制备 9 上柱 10 洗脱 11 凝胶柱的再生与保存 凝胶层析操作过程主要可分为三大步骤 装柱上柱洗脱凝胶层析实验操作过程 一 层析柱的选择 层析柱是所有层析方法的主要主要组成部分 对层析柱选择合理与否将直接影响分离效果 选择层析柱主要考虑被分离组分相对分子质量的差异 1 分离相对分子质量差别较大的样品可采用短粗的层析柱 柱长度 柱内径 10 1或20 1 如脱盐柱 2 分离相对分子质量差别较小的样品 可采用细长的层析柱 柱长度 柱内径 50 1 或100 1如 蛋白质组分分离 层析柱简介 层析柱简介 1 普通层析柱2 中压柱3 尼龙膜 层析柱简介 层析柱是凝胶层析技术的主体 工厂中的层析柱 层析柱简介 低压凝胶层析柱 二 装柱 装柱的方法可分为湿装法和干装法两种湿装法 加适量溶剂到柱内排走空气搅匀预先用溶剂浸泡好的吸附剂将此悬浮连续倒入柱中自然沉降 至柱高1 4 1 3 打开柱的下端口溶剂流出 柱上端悬浮液下降至所需高度干装法 直接加吸附剂到柱中 然后倒入溶剂 湿装法对各种基质都适用 装柱应注意事项 在装柱前要在柱的底部放置一层玻璃纤维或者棉花 层析柱中基质应符合填装均匀 一致和没有松紧气泡的标准 所以装柱时 吸附剂表面要平整 应使其一直浸泡在溶剂的中 防止气泡或裂纹产生 三 流动相的选择 在选择凝胶过滤所使用的缓冲液主要考虑三方面因素 1 被分离物质的稳定性 包括缓冲液的PH 离子强度及保护剂 2 凝胶介质的稳定性 要求不与介质发生化学反应 不变形 不降解 3 分离物质后处理 被分离组分经凝胶过滤分离后如还需采用其他方法进一步分离 该采用与后续层析方法同一缓冲液 如果后处理是冰冻干燥 可选用易挥发性的溶液 如HAC和NH4OH 四 样液的制备 样品在上样前要进行适当的处理 如通过离心 沉淀 抽提等方法以去除杂质 样液的浓度不宜太稀也不宜太浓 组分不宜太多 五 上柱 上柱是将欲分离的混合液加入凝胶层析柱的过程 要在洗脱液的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入混合液 使组分能够均匀的进入凝胶床 上柱的混合体积常为凝胶床体积的10 左右 最大不能超过30 混合液的浓度可以高些 但是黏度宜低 六 洗脱 样品加入后打开流出口 使样品渗入凝胶床内 当样品液面洽与凝胶床表面相平时 再加入数毫升洗脱液洗管壁 洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及装柱平衡时所使用的液体完全一致 否则会影响分离效果 使其全部进入凝胶床后 将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连 预先设计好流速 一般来说 洗脱流速慢 分离效果好 但是太慢也会因扩散加剧而影响分离效果 另外洗脱时的流速要严格控制 否则收集的每一部分洗脱体积就不会恒定 理想的分配技术就难以测出 控制流速的最好装置是恒流泵 流速对洗脱曲线峰形的影响 洗脱剂的流速对分离效果也有很大的影响 下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线 可见在较快的流速下得到的洗脱峰较宽且低 流速低洗脱峰窄而高 也就是说流速较低 分辨率较高 恒流泵 欲达到流速恒定的目的 可自己恒压加液装置 下图 更可靠的是使用微量恒流泵 如果没有恒流泵该怎么办 没有恒流泵的情况下可用控制操作压的办法 其操作压是通过两个液面之间的距离来控制的 流速与操作压关系 洗脱时 流速与操作压有关 与凝胶的型号与粒度也有关 在同样的操作压下 洗脱时往往编号小的葡聚糖凝胶 以及颗粒粗的凝胶流速大 编号大的 粒度细的流速慢 对于某种凝胶来说 在一定范围内 操作压加大 流速加快 对于强度大的凝胶 如SephadexG10 50 在相当大的柱压范围内流速 V 与操作压 F 成正比 与柱长 L 成反比 V K P L但是对于强度差的凝胶