基因重组蛋白纯化流程.doc

01.11周总结一、本周工作010520TTB23蛋白处理1、分析昨天20TTB23蛋白跑小胶的情况，硫胺分析上清基本无目的蛋白，因此放弃处理上清；2、沉淀中目的蛋白比较明显 ，观察小胶2M尿素溶解上清中目的蛋白较少，6M、8M溶解的沉淀中目的蛋白量较少，因此考虑用2M尿素去杂蛋白，用6M尿素洗目的蛋白；3、用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min,再重复一遍；4、用30ml 2M尿素溶液（含20mmol/L Tris-Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；5、用15 ml 6M尿素溶液将蛋白吹起，超声2min,冰箱中放置2h，超声2min,12000转离心30min;6、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清测蛋白浓度，往上清中加7.5ml的5*loadingbuffer,取40微升跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，用注射器往每板大胶中加3微升样品，进行电泳；20TI56II12菌体回收1、该蛋白共两瓶，平均装入3只大离心管中，7000rpm离心3min；2、去上清用20ml裂解液吹起，超声破碎3*4min,观察蛋白溶液显白色，预计为沉淀表达;3、12000rpm离心25min，去上清，沉淀放冰箱明天处理；01.0620TTB23蛋白回收：1.将跑20TTB23蛋白的凝胶从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白带；2、用手术刀轻在蛋白带上画一条线，描出蛋白的前带；3、用手术刀以垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条宽1cm左右的条带，在条带的末尾用手术刀切成不同的形状，以便区分，将凝胶条放到氯化铜染色液中染色；4、染色完成后根据凝胶条上目的蛋白染色的宽度确定凝胶上目的蛋白的宽度与位置；5、根据染色后目的蛋白的分布，确定切胶的宽度和上让、下让的宽度，用手术刀将目的蛋白条从凝胶上切下，用蒸馏水冲洗几遍；6、将含目的蛋白的凝胶条放到透析袋中扎紧袋口，在放1*SDS缓冲液的电泳槽中电洗脱2H；7、电洗脱后收集目的蛋白溶液，稀释12倍后，紫外分光光度计测浓度，280nmOD值为0.165,260nmOD值为0.098，C=（0.165*1.450.098*0.74）*12=2.0；20TI56II12蛋白处理：1用正常Buffer将沉淀再洗两遍，用15ml/P Buffer溶液将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min,重复两遍；2、用30ml 2M尿素溶液（含20mmol/L Tris-Hcl）将沉淀吹起，超声2min,12000rpm离心15min，弃上清；3、查以前的实验记录，用10.4ml 8M尿素溶液将蛋白溶解，超声2min,冰箱中4度放置2h，超声2min,13500转离心30min;4、将上清倒至一洗净的烧杯中，取上清稀释24倍测蛋白浓度，280nmOD值为1.041,260nmOD值为0.579，C=（1.041*1.450.579*0.74）*24=25.9；往上清中加2.6ml的5*loadingbuffer,取40微升于1.5ml离心管中跑粗抗胶，其余放到冰箱等待上大胶；7、将大胶夹好后，观察粗抗胶的染色情况，用注射器往每板大胶中加3微升样品，共加4板，进行电泳01.07协助回收20TI56a、20TI56、20TI56bII12蛋白1准备好切胶所需的玻璃板，手术刀、镊子等器具，用纯水洗净后整齐摆放在切胶台上（不能直接接触切胶台，要用干净纸巾垫好）；2、将凝胶板从电泳槽上拆下，观察凝胶上的蛋白前带，用手术刀沿前带轻轻描一条线；3、在垂直于蛋白带的方向在凝胶中间切下一条1cm左右的凝胶条放在5%Cucl2溶液中染色，染色过程中注意轻轻摇晃染色盒；4、染色后观察目的蛋白在凝胶上的位置、确定切胶的宽度；5、用手术刀将目的蛋白带切下，切胶过程中注意不要产生碎渣，并用纯净水将切下的凝胶条冲洗干净；6、将切下的凝胶条放在透析袋中，加适量缓冲液扎紧袋口，在电泳槽中电洗脱2h之后，反插导线洗脱5min；7、洗脱后回收透析袋中的蛋白溶液，稀释12倍后测蛋白溶度，放冰箱4C保存。0109破碎分析P4HB85P256蛋白：1、测菌浓度，取4只比色皿往第一个比色皿中用800微升移液枪打入2.4ml纯净水作为对照管，其它几个比色皿中加入1.6微升纯水后，再加入800微升的菌液混匀，注意每取一个细菌培养液时要更换一次移液枪头，将比色皿放在紫外分光光度计中在600nm波长条件下检测OD值为0.856；2、制作大表：取1.5ml菌液于离心管中 12000rpm离心2min 吸去上清 往离心管中加入40微升水，20微升3*loadingbuffer，注意吹匀沸水煮10min,12000rpm离心6min 去上清液5微升跑小胶观察蛋白表达情况；3、破碎，将2瓶P4HB85P256培养基平均装在3只大离心管中，7000rpm离心3min后倒掉上清，倒扣在纸巾上吸干水分 用20ml的裂解液将沉淀吹起，超声4min*3,每次间隔3min，;4、离心，静置30min后，12000rpm离心25min,将上清倒置另一离心管中；5、将上清液进行5%-50%SAS浓度梯度分析，发现所有上清都有沉淀，于是再增加2%、3%、7%、8%的SAS浓度梯度进行分析；5、加不同浓度的SAS后静置30min,12000rpm离心6min,观察各SAS浓度下沉淀出现情况，发现2%SAS条件下就有沉淀出现；6、由于该蛋白对SAS很敏感，选择用SAS为2%、3%、5%的样做上清和沉淀样，用SAS为7%、8%、10%、15%、20%、25%的样做上清样，做样时先取相应数量的1.5ml离心管，往管中加入10微升的3*loadingbuffer，并在管上标明样品名称，再加入20微升的相应样品并混匀；7、跑小胶，将预先制好的13%小胶夹到电泳槽上，按大表，总沉淀，总上清，2%、3%、5%沉淀样，2%、3%、5%、7%、8%、10%、15%、20%、25%上清样的顺序上样，其中总沉淀上7.5微升，上清样按不同浓度对应的量上样，其它上5微升，注意每次上样时要将针清洗3遍；8、电泳，上样完毕后用导线盖将电泳槽连到电泳仪上，调节电压100V左右，样跑平后调节电压200V,直到指示剂跑到板底，结束电泳，将小胶拆下染色分析。01.10P4HB85P256蛋白处理1、 根据跑粗抗胶的情况确定蛋白的处理方式为5%SAS直沉；2、 用移液枪测得粗抗体积为20.8ml,加入饱和SAS的体积为V=（20.8*5%）（15%）=1.09ml,在冰浴的条件下将SAS加入，注意加入时速度不能太快；3、 4C环境放置30min;4、 12000rpm离心25min,去上清;5、 参照以前的实验记录，用8ml 20mM PB将沉淀吹起；6、 配置600ml 20mMPB+200mMNacl平衡溶液（三个蛋白共用）；7、 准备一个10ml柱子，加3ml介质，加介质后让保护介质的酒精滴下，用6ml平衡液洗5次，每次在柱子中静置2min，注意每次洗柱子的过程中不要让介质太干，以刚刚好液体滴完为止;8、 将吹起的蛋白溶液12000rpm离心15min;9、 离心完后将上清加到柱子上亲和吸附1h(4C条件下),注意此时柱子要盖上盖子，以防污染；10.用平衡液做稀释液配置100ml 200mM 咪唑+20mMPB+200mMNacl洗脱液，准确量取咪唑200*100*68.8/1000*1000=1.376g,用200ml平衡液溶解，再量取8ml洗脱液，用平衡液定容到80ml配成20mM 咪唑+20mMPB+200mMNacl洗杂液；11.将亲和柱从冰箱中取出，在室温下静置5min左右后，收集从柱子中流出的穿透液；12.往柱子中加入6ml平衡液，静置2min,放掉平衡液并收集1ml左右液体做样，用同样方法平衡9次收集第1次，第5次，第9次的平衡液做样（注意每次加平衡液后需要轻轻搅动一下柱子，但不要太猛烈以防吸附的蛋白脱落）；13.洗杂：往柱子中每次加入6ml的平衡液，洗杂5次，每次停留2min,用5ml离心管收集洗杂液；14、洗脱：往柱子中加入2ml、2ml、1.5ml、1.5ml、2ml、2ml的洗脱液，每次停留10min,收集每次洗脱液；15、将粗抗、总上清、穿透液、加样后收集的平衡液、洗杂液、洗脱液做样跑13%的小胶分析蛋白分布情况；01.11LXLMA29蛋白破碎分析：1 将菌溶液稀释3倍，600nm测吸光度值，P4SD-S7 0.553、32ETO10 0.675、LXLMA29 0.871；2、制作大表，取1ml 菌溶液，12000rpm离心2min,吸去上清，将沉淀用40微升纯水吹起，加入20微升loadingbuffer,煮10min,12000rpm离心10min;3、将菌溶液平均装在大离心管中7000rpm离心3min,去上清，沉淀用10ml/p裂解液吹起；4、将沉淀进行超声裂解,进口超声仪用70%功率，2瓶培养基超声4min*3,中间停留2min;5.超声完后，将裂解液倒入离心管12000rpm，离心25min;6.观察沉淀颜色，如为褐色可能是上清表达，将上清用另一只离心管收集，并做一个总上清样，沉淀用正常buffer吹起，做一个总沉淀样；7上清SAS梯度分析，做从10%-50%的硫胺梯度，取上清90、85、80、75、70、65、60、55、50微升加入10、15、20、25、30、35、40、45、50微升的饱和SAS，静置30min，12000rpm离心6min；8.观察沉淀出现的情况，用25%作为中间梯度，SAS浓度小于25%的将上清吸掉，沉淀用20微升纯水吹起加10微升3*loadingbuffer做样，大于25%的取20微升上清做样，25%的即做沉淀又作上清样；9、按一定的顺序将样品上小胶电泳后，将小胶用考马斯亮蓝染色液染色，再微波加热脱色分析蛋白分布情况；二、本周学习情况:1. 学习了包涵体的尿素处理过程，以及包涵体性质包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。形成原因：1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。2、学习IPTG的诱导原理E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I，I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个代谢物基因激 活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表 达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结 合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子即可被诱导，乳糖进入细胞，经b半乳糖苷 酶催化，转变为半乳糖，后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一 种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被用作诱导剂。3、学习亲和层析 原理利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。可以选用生物化学、免疫化学或其他结构上吻合等亲和作用而设计的各种层析分离方法。如用金属螯合柱分离带有成串组氨酸标签的重组蛋白