细菌内毒素检查法ppt课件

细菌内毒素检查法 药分教研室丁晓红 三 细菌内毒素检查法 一 概述1 内毒素 Endotoxin 即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖 其毒性成分为类脂A 菌体死亡崩解后释放出来 2 细菌内毒素检查法 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素 以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法 3 什么是鲎试剂 鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品 含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原 凝固蛋白原 能够准确 快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 1 3 葡聚糖激 鲎的图片 鲎的长相既像虾又像蟹 人称之为 马蹄蟹 是一类与三叶虫 现在只有化石 一样古老的动物 鲎的血液中含有铜离子 它的血液是蓝色的 这种蓝色血液的提取物 鲎试剂 可以准确 快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病 在制药和食品工业中 可用它对毒素污染进行监测 4 检查方法 包括两种方法 即凝胶法和光度测定法 后者包括浊度法和显色基质法 供试品检测时 可使用其中任何一种方法进行试验 当测定结果有争议时 除另有规定外 以凝胶法结果为准 5 检查的意义 注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射剂安全性的重要质量指标 二 凝胶法1 原理 通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法 限量 阳性对照 灵敏度 溶剂 稀释倍数 内毒素的量用内毒素单位 EU 表示 该法优点 快速 灵敏 2 细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂 细菌内毒素国家标准品 RSE 系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素 用于标定细菌内毒素工作标准品的效价 复核 仲裁鲎试剂灵敏度 细菌内毒素工作标准品 CSE 系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定 确定其质量的相当效价 1ng工作标准品效价应不小于2EU 不大于50EU 用于鲎试剂灵敏度的复核 干扰试验及设置的各种阳性对照 细菌内毒素检查用水 BET水 系指内毒素含量小于0 015EU ml的灭菌注射用水 是细菌内毒素检查专用水 鲎试剂和鲎试剂灵敏度 a 鲎试剂的生产 利用鲎血制备而成 鲎试剂的种类 美洲鲎试剂 LAL 中国鲎试剂 TAL 圆尾鲎试剂 CAL B 鲎试剂的规格 是指每支鲎试剂的装量 如 0 1ml 0 5ml 一般来说 规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶 如 0 1ml就用0 1ml细菌内毒素检查用水复溶 C 鲎试剂标示灵敏度 细菌内毒素检查的规定条件下 使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度 用EU ml表示 如 入 0 5EU ml 细菌内毒素的限值 L 哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐受力 只有内毒素超过一定的限度 才会引起热原反应 因此内毒素的检查是一个限量检查 只要不超过限值 产品就合格 确定限值的方法 从质量标准正文中查出 最大有效稀释倍数 MVD 供试品溶液被允许稀释的最大倍数 在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定 MVD CL 入 L 内毒素限值 c 供试品溶液浓度 当L以EU ml表示时 c 1 0ml ml 当L以EU mg或EU u表示时 c的单位为mg ml或u ml 如 供试品为注射用无菌粉末或原料药 则MVD 1 例如 称取mg供试品 Vml 移取注射液xml Vml MVD C最大有效 L m v L c样 入 c样 入 L EU mg L x v L MVD 入 MVD 入 L EU ml 3 检查方法 1 检查程序 实验试剂 仪器及用具等的准备 除内毒素 确定药品的细菌内毒素限值L 选择鲎试剂的灵敏度入 计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度 鲎试剂灵敏度的复核 药品与鲎试剂的相容性的初选实验 无干扰浓度初选 供试品的干扰实验的验证 正式干扰试验 供试品日常的内毒素限量检查 在实际操作过程中 1 4 顺序可变 5 8 顺序不能变 2 实验准备A 除去干扰 试验所用器皿需经处理 以除去可能存在的外源性内毒素 常用的方法是250 干烤至少1小时 也可用其它确证不干扰细菌内毒素的适宜方法 若使用塑料器械 如微孔板和微量加样器配套的吸头等 应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 试验操作过程应防止微生物的污染 B 材料与器具 细菌内毒素工作标准品 鲎试剂 细菌内毒素检查用水 漩涡混合器 37 1 试管恒温仪 稀释 移液容器 试管架或试管浮板 酒精灯 消毒酒精棉球 剪刀 砂轮 镊子 封口胶布标记纸等 3 鲎试剂灵敏度的复核试验A 复核的条件 本检查法规定的条件下 使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度 用EU ml表示 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时 应进行鲎试剂灵敏度复核试验 B 操作 0 1ml 支规格鲎试剂原安瓿18支 复溶 0 1ml 内毒素检查用水 4支 4支 4支 4支 2支 2 0 内毒素溶液 1 0 内毒素溶液 0 5 内毒素溶液 0 25 内毒素溶液 内毒素检查用水 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 0 1ml 内毒素工作标准品或国家标准品 内毒素检查用水溶解15min 稀释 37 1 保温1h 呈阳性 呈阴性 结果有效 计算鲎试剂灵敏度 式中 X为反应终点浓度的对数值 lg 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度 当 c在0 5 2 0 时 方可用于内毒素检查 并以 C为该批鲎试剂灵敏度 4 细菌内毒素检查 凝胶法 干扰试验按表制备溶液A B C和D 使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数 MVD 的溶液 按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作 干扰试验结果判定 前提 A和D的所有平行管都为阴性 并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时 试验方为有效 按下列计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值 Es和Et Es lg 1 Xs 4 Et lg 1 Xt 4 式中Es Et分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值 lg 当Es在0 5 2 包括0 5 和2 及0 5Es 2Es 包括0 5Es和2Es 时 认为供试品在该浓度下无干扰作用 若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰 应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释 再重复干扰试验 注 A为供试品溶液 B为干扰试验系列 C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D为阴性对照 5 检查方法 取内毒素的工作标准品一支 用水稀释至2入浓度溶液 取检品S 计算MVD 把它稀释成SMVD 取鲎试剂8支 0 1ml 支 2支作为样品检查管 S1 S2 2支标记为阳性对照 2支为阳性产品对照 2支标记为阴性对照 举例 清开灵注射液中细菌内毒素的检查 设检品为S L 1 0EU ml 选用效价为0 06EU 支 入 0 06EU ml的鲎试剂 使用的细菌内毒素的工作标准品的效价为10EU 支 参数及MVD已经过预试验验证 操作步骤 1 取内毒素的工作标准品一支 用水稀释至2入浓度溶液 即E0 12 2 计算最大稀释倍数MVD L 入 1 0 0 06 16倍 3 取检品S 把它稀释呈SMVD 0 2mlS 3 0ml水 SMVD16 4 取鲎试剂8支 0 1ml 支 两支作为样品检查管 S1 S2 2支标记为阳性对照 2支为阳性产品对照 2支标记为阴性对照 如下图所示 5 封闭管口 摇匀 放入37 1 的恒温水浴保温60 2分钟 取出观察结果 记录结果 6 结果的判断及处