RT-qPCR技术的原理及应用.ppt

实时荧光定量PCR技术的原理及应用 RealtimeQuantitativePCR 1 实时荧光定量PCR定义 2 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 3 实时荧光定量PCR原理应用 绝对定量 AbsoluteQuantification AQ 病原体检测转基因食品检测基因表达研究 相对定量 RelativeQuantification RQ 高通量基因检测方法的验证药物疗效考核耐药性研究 4 实时荧光定量PCR原理应用 中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测摘要目的 探讨肝组织中HBVDNA和病毒转录体与终末期肝病的关系 方法 用TRIzol从肝组织中提取组织核酸 PCR及RT PCR扩增HBVXDNA XRNA fRNA和trRNA 琼脂糖凝胶电泳显示产物 Southern blot杂交验证PCR扩增的可靠性 结果 27例HBsAg 肝组织 19例HBxDNA RNA检测均为阳性 其中HBeAg 者fRNA检出率较HBeAg 者高 22例HBsAg 肝组织 有16例可检测到HBxDNA或RNA HBsAg 的隐匿性感染在中国人终末期肝病中有较高的检出率72 7 HBV病毒转录体trRNA在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏疾病 P 0 05 结论 HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病的发生密切相关 肝组织中HBVtrRNA也与终末期肝病关系密切 5 实时荧光定量PCR原理应用 6 实时荧光定量PCR原理应用 7 实时荧光定量PCR原理实时原理 常规PCR技术 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量 无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化 通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 8 实时荧光定量PCR原理 Ct值的重现性 Ct值的特点 相同模板进行96次扩增 终点处产物量不恒定 Ct值则极具重现性 9 实时荧光定量PCR原理 定量原理 理想的PCR反应 X X0 2n非理想的PCR反应 X X0 1 Ex nn 扩增反应的循环次数X 第n次循环后的产物量X0 初始模板量Ex 扩增效率 10 非特异性荧光标记 1 SYBRGreen特异性荧光标记 2 TaqMan 实时荧光定量PCR原理 DNA产物的荧光标记 11 实时荧光定量PCR方法1 SYBRGreen法 SYBRGreen 12 SYBRGreen法工作机理 SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位 SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时 DNA双链分开 无荧光复性和延伸时 形成双链DNA SYBRGreen发荧光 在此阶段采集荧光信号 SYBRGreen 13 实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理 14 SYBRGreen法融解曲线分析 15 SYBRGreen法 PCR反应的建立 反应体系的建立及优化 SYBRGreen使用浓度 太高抑制Taq酶活性 太低 荧光信号太弱 不易检测Primer 引物的特异性高 否则扩增有杂带 定量不准MgCl2的浓度 可以降低到1 5mM 以减少非特异性产物反应Buffer体系的优化反应温度和时间参数 由酶和引物决定其他与常规PCR相同 16 SYBRGreen法应用范围 起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析 可以优化PCR反应的条件 对常规PCR有指导意义 如对primer的评价 可以区分单一引物 引物二聚体 变异产物 多种产物 17 实时荧光定量PCR法标准样品 相对定量中的内标内标通常是 actin GAPDH 18SrRNA基因等看家基因在细