衍生化HPLC-MS法测定血浆中超微量炔雌醇

丹酰氯柱前衍生化HPLC APCI MS法测定血浆中超微量炔雌醇及其人体药动学研究 1 简介 复方醋酸环丙孕酮片达英 35 参比制剂 由德国先灵公司生产 每片含醋酸环丙孕酮 CPA 2mg和炔雌醇 EE 35 g 醋酸环丙孕酮为17 羟孕酮类药物 炔雌醇是雌二醇的17 乙炔基衍生物 由于CPA和EE血药浓度相差150倍 并且由分子式看出二者的理化性质也有较大差异 同时测定有难度 所以需要分开测定之 建立方法 丹酰氯柱前衍生化 LC APCI MS测定人血浆中pg ml级炔雌醇的方法 2 血浆中pg ml级炔雌醇测定方法的介绍 2 1外国文献报道受试者口服低剂量的炔雌醇后 其血药浓度测定常用放射免疫法 最低定量限为8 20pg ml 1 优点 具有较高的检测灵敏度缺点 精密度 重现性 准确度都不如LC MS GC MS法 2 2外国文献报道GC MS法测定人血浆中炔雌醇 其LLOQ为10pg ml 1 每个样品分析时间长达几十分钟 并不适合于大批量血浆样本的高通量测定要求 而且该文献并没有炔雌醇人体药代动力学数据 2 3外国文献报道采用LC MS法测定炔雌醇甲醇溶液 LLOQ为50ng ml 我们根据文献初步折算 提取浓缩10倍后其血药浓度LLOQ最多为5ng ml 距离血药浓度为10pg ml的要求相差了500倍 灵敏度太低 2 4初步尝试 采用较为普及的LC ESI MS LC APCI MS单级质谱测定炔雌醇的甲醇溶液 检测离子 M H 结果与外国文献报道相近 LLOQ为30ng ml 1 远远达不到检测的要求 有300倍的差距 酚羟基容易失去一个H 3 难点 人血浆中pg ml级炔雌醇的测定 如何利用现有的 比较普及的LC MS测定pg ml的炔雌醇呢 进一步文献调研 外国有将雌激素类用丹酰氯衍生化后进行紫外 荧光 电化学检测的报道 3 1衍生化试剂 丹酰氯的分子结构 Weber于1952年合成了丹酰氯 Dns Cl 最早用来测定N 末端氨基酸及用于对蛋白质结构的确定 C12H12CINO2S分子量269 75 具有强烈荧光 紫外吸收的萘环 作为衍生化紫外 荧光标记试剂以提高待测物的检测灵敏度及色谱保留行为 已大量的应用于生物样本中氨基酸类及多胺化合物等含有伯 仲胺基 酚羟基的化合物的衍生化含量测定和临床的疾病诊断 3 2丹酰氯的应用介绍 3 3含有仲 叔氮原子的化合物由于碱性较强 在质谱测定中易于结合氢离子 化合物的质子化效率较高 具有较高的质谱响应 恰好丹酰氯分子中含有叔氮原子 磺酰氯基能与炔雌醇的酚羟基发生反应 考虑用丹酰氯将炔雌醇衍生化后 引入碱性较强的叔氮原子 将质谱响应较低的酚羟基 转变为响应很强的叔氮原子 产生新的质谱响应活性中心 提高炔雌醇的离子化效率增强质谱响应 M H M H 3 4炔雌醇的丹酰氯衍生化方程式 新的检测分子 3 5对羟基联苯 内标 的衍生化方程式 3 6新的检测离子的产生 结果如前所料 衍生化以后 炔雌醇和内标引入了丹酰氯的叔氮原子 其碱性较强 所以与H 形成 M H 正离子 3 6 1炔雌醇的丹酰氯衍生物正离子质谱扫描图 3 6 2内标的丹酰氯衍生物正离子质谱扫描图 H 4血浆样品中炔雌醇的LC MS测定法的建立与考证 实验条件血浆样品的处理炔雌醇的本底方法特异性方法学实验结果 4 1实验条件 色谱条件流动相 甲醇 含1 甲酸的10mmol L醋酸铵水溶液 97 3色谱柱 Lichrospher C18dp5 m4 6mmID 25cm 淮阴汉邦科技 流速 1ml min柱温 25 质谱条件MSD 选择性离子监测 离子极性 正离子 离子化方式 大气压化学离子 APCI 检测对象 炔雌醇的衍生物 M H m z530 3 内标的衍生物 M H m z403 3 传输区电压 150V干燥气流速 4 0L min 1 雾化室压力 60psig干燥气温度 350 4 2血浆样品的处理 血浆样品1 0ml 内标 20ng ml 50ul 涡旋混匀 乙酸乙酯5ml 涡旋3min 3000r min 离心10min 取有机层 50 水浴 氮气流吹干 残渣进行衍生化反应 将反应液于16000r min 离心2min 直接取上清液进样 4 3残渣衍生化反应的详细步骤 提取残渣 100mmol L 1的碳酸氢钠缓冲液100 l 2mol L 1氢氧化钠水溶液调节至pH10 5 加塞 涡旋1min 加入3mg ml 1的丹酰氯丙酮溶液100 l 加塞 涡旋1min 55 水浴反应50min 4 4炔雌醇的本底 外国文献报道 没有服用炔雌醇人体内也可能会存在一定浓度的本底 范围为0 30pg ml 推测炔雌醇本底可能来源人体内源性类固醇或者由食物中 特别是饮用水和肉类 引入 计算药动学参数时必须扣除本底的影响 4份来源不同的空白血浆提取物的衍生物色谱图 4 5方法的特异性 B C A 炔雌醇对照品的衍生物色谱图 B 对羟基联苯对照品的衍生物色谱图 A B D C C 空白血浆加入炔雌醇 104 3pg ml 对羟基联苯对照品的标准含药血浆色谱图 D 健康受试者口服复方醋酸环丙孕酮片后的炔雌醇 53 52pg ml 血浆样品 加入内标 色谱图 4 5炔雌醇标准含药血浆最低定量限 LLOQ 10 43pg ml 衍生化后炔雌醇的质谱响应增大了300倍 炔雌醇标准含药血浆LLOQ为10 43pg ml丹酰氯衍生化炔雌醇 4 6炔雌醇方法学实验结果 炔雌醇的标准曲线线性范围为 10 43pg ml 1 625 8pg ml 1r 0 99876 最低定量限为10 43pg ml 高 中 低三种浓度的日间和日内精密度均小于15 4 7炔雌醇数据分析和结果 20名受试者分别口服参比和受试两制剂后的炔雌醇的平均血药浓度 时间曲线 4 820名女性受试者两轮空白血浆中炔雌醇的本底血药浓度曲线 浓度范围为0 33pg ml与外国文献报道一致 5 1关于丹酰氯在质谱中新应用的讨论 丹酰氯常用于氨基酸等含有伯 仲氨基和酚羟基的化合物的柱前衍生化含量测定 能化合物的紫外和荧光吸收 提高了检测灵敏度 增强色谱保留行为 可以查阅到大量的丹酰氯应用于HPLC UV和HPLC FID检测的报道 同时丹酰氯还有一个叔氮原子 有较强的碱性很容易与氢离子结合为正离子 极大的增加了化合物的离子化效率 从而增强了质谱响应 待测化合物