2010CB912500-细胞膜重要脂质代谢产物对重大疾病病理生理过程的调控.doc

项目名称：细胞膜重要脂质代谢产物对重大疾病病理生理过程的调控首席科学家：朱毅 北京大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容花生四烯酸被COX、LOX和CYP三条途径代谢生成上百种结构相似，但具有不同生物活性的代谢产物，在生命活动和多种重大疾病过程中发挥重要的作用。然而，许多重要花生四烯酸代谢产物的作用机制和关键的作用靶点等尚不完全清楚。特别是花生四烯酸代谢一条通路出现异常或者改变时，会如何影响其他代谢途径、会如何影响生物体的整体代谢，上述影响有什么病理生理学意义等重要问题仍然需要深入研究。另外，花生四烯酸代谢依赖几十种相关酶的共同作用，而上百种代谢产物与相应的蛋白质（包括受体、信号分子等）结合和相互作用，共同介导了花生四烯酸系统对细胞和器官功能的影响。任何外界刺激或细胞功能状态改变导致的花生四烯酸代谢通路的改变，必然影响各通路代谢产物之间的稳态，进而造成细胞乃至机体的功能紊乱。本项目将现代生物学方法和转基因/基因敲除等模式动物相结合，横向研究在不同的生理病理状态下花生四烯酸代谢途径和产物的变化及其重要代谢产物与相关蛋白质相互作用的机制，进而阐明花生四烯酸代谢系统在不同病理生理状态下的作用。（一）关键科学问题：本项目针对“花生四烯酸代谢通路不同产物之间形成的网络、及其与相关蛋白质的相互作用机理、影响生物代谢组的规律以及对重要病理生理过程的调控作用机制”等关键科学问题开展研究。（二）主要研究内容围绕我们提出的关键科学问题，根据前述的目前国际和国内研究现状以及我们具备的条件和前期工作基础，本项目以花生四烯酸代谢为中心，以代谢产物与相关蛋白相互作用和调节为主轴,针对花生四烯酸代谢产物在重要生理及病理生理过程中的调节作用，拟运用代谢组学、蛋白组学、结构生物学和模式动物结合的方法展开研究。本项目主要研究内容将在以下三个层面展开：1、阐明花生四烯酸的三大代谢通路中不同的代谢产物间的网络调控和代谢调节的关键因素，以及花生四烯酸代谢改变对整体和特定组织器官代谢组的影响（1）首先在细胞水平，研究环氧酶（COX-1和COX-2）、脂氧酶（5-LOX，12-LOX， 15-LOX1和 15-LOX2）及P450单氧酶(表氧酶和w-羥化酶)三大代谢通路的代谢产物，以期明确花生四烯酸的所有活性代谢产物代谢谱的变化，并可望发现新的生物活性物质；（2）运用花生四烯酸三大代谢通路关键合成酶基因的敲除小鼠模型，借助代谢组学手段研究动物组织、血液和尿液中的花生四烯酸代谢产物以及整体代谢组的变化规律，以阐明单一通路阻断对其他通路代谢产物的影响；（3）在细胞和整体动物水平研究在单一代谢途径阻断的情况下，重要病理生理刺激因素对花生四烯酸代谢产物种类和合成水平的影响，以明确花生四烯酸不同代谢产物间的网络调控机制。2、重要的花生四烯酸代谢产物与相关蛋白的相互作用（1）利用结构生物学和分子生物学手段明确COX及LOX产物与其相应膜受体结合的结构基础和介导不同信号通路的分子机制。该研究将有助于阐明同一花生四烯酸分子调节不同生理和病生理过程以及不同产物参与同一生理及病生理过程调节的分子基础； （2）研究花生四烯酸代谢产物与代谢性核受体相互作用的机制及其生物学作用，该项研究将可揭示花生四烯酸代谢产物通过核受体调控重要生理、病理生理过程的机制及与重大疾病的关系；（3）发现与重要花生四烯酸代谢产物（包括COX代谢产物前列腺素、前列环素、血栓素；LOX代谢物白三烯、5-HETE和15-HETE和CYP代谢物EETs和w/w-1-HETE）相互作用的新的蛋白分子，以阐明花生四烯酸代谢产物参与重要生理及病生理过程调节的机制；（4）应用分子和细胞生物学手段在重要花生四烯酸代谢产物受体及其作用蛋白转基因或基因敲除动物模型中研究相应花生四烯酸代谢产物与相关蛋白质的相互作用及其机制。3、花生四烯酸代谢产物对重要生理病理过程的调控作用及其机制（1）在细胞水平研究重要花生四烯酸代谢产物对细胞增殖与分化、糖、脂代谢以及炎症过程等重要生理病理过程的影响及其机制；（2）在整体动物水平，利用模式动物和基因敲除动物研究花生四烯酸代谢产物与上述生理病理过程及其功能紊乱引起的相应重大疾病的关系。我们将本着“有所为，有所不为”的原则，以这些病理生理变化对心血管系统影响为重点展开研究；A. 以高脂血症等疾病模式研究重要花生四烯酸代谢产物对脂代谢的影响和其代谢紊乱与高脂血症发生的关系；B. 以具有慢性血管炎症为特征的动脉粥样硬化为切入点，探讨花生四烯酸代谢产物调控血管内皮细胞功能，参与对动脉粥样硬化发生、发展的机制； C. 心血管细胞的损伤与重塑发生是细胞增殖与分化失衡的结果。以高血压、心肌肥大及内膜新生为模型，研究不同花生四烯酸代谢产物在心肌细胞和血管平滑肌细胞中对细胞增殖与分化的影响。上述研究的完成不仅将完善我们对花生四烯酸活性产物复杂网路调节的认识，也有助于明确花生四烯酸代谢产物调节重要病理生理过程的机制和分子基础；也将有助于阐明花生四烯酸对人类重大疾病（高血压、动脉粥样硬化和心肌病）病程的影响。上述研究的完成也将可能发现一些花生四烯酸代谢的新产物或新功能，为干预上述重要病生理过程和相关疾病提供潜在的药物靶点。二、预期目标（一）总体目标：本项目旨在以花生四烯酸代谢与重要生理病理过程调节为重点，通过组学研究与模式动物研究相结合的多中心、跨学科的联合研究，整合国内优秀团队，砺练一支花生四烯酸代谢相关研究的队伍，进一步完善相关的研究体系，为我国在这一重要研究领域跻身国际先进行列提供基础和条件。我们预期在今后5-10年内逐步阐明花生四烯酸在不同的生理、病理状态下代谢的规律以及不同代谢途径间的相互关系；在该领域获得突破，并在国际上处于领先水平。确定重要的花生四烯酸代谢物与蛋白质和受体的相互作用及机制、引起的信号和网络调节的变化，这些小分子化合产物及相关联的蛋白分子在生理和病理生理网络调节中的位置等。明确重要的花生四烯酸代谢产物在细胞增殖、分化、炎症等重要生理病理过程中的作用，分子机制和关键的作用靶点；在基于花生四烯酸代谢产物的自主创新的药物开发，和某些重大疾病的诊断标志等方面获得一批有自主知识产权的重要成果；为疾病治疗提供理论基础和潜在靶点，从而为下一步研究疾病的防治策略、治疗决策和新药开发提供依据。（二）五年预期目标：在项目资助的五年内，我们拟实现以下目标：1. 阐明干预花生四烯酸单一代谢通路引起的整体代谢产物的相互消长关系、调节网络和其介导的主要病理生理学功能；2. 阐明花生四烯酸代谢通路和代谢产物在几个重大疾病（动脉粥样硬化、高血压、血管再狭窄和心衰）的病理生理过程中的作用靶点和机制；3. 以重要花生四烯酸代谢产物为探针分子研究它们在重要心血管疾病中的作用，揭示花生四烯酸代谢产物与相关疾病发生关系，为发现具有潜在应用价值的药物靶点奠定基础； 4. 完善和加强代谢组学技术平台以及花生四烯酸代谢相关的转基因小鼠和组织特异性基因敲除小鼠等模式动物平台；运用几种重要的花生四烯酸代谢酶基因和几个重要的代谢物受体转基因或基因敲除动物，完成在非干预状态下和不同干预状态下重要组织器官基因表达谱和蛋白组学研究。5. 发现10-20个重要的调节或功能蛋白，着重研究和阐明其中5-10种重要蛋白的作用和在调节网络中的作用和位置；6. 针对花生四烯酸代谢相关的酶、受体、作用靶点，建立专门的基因芯片和蛋白质芯片，用于课题模式动物和细胞基因和蛋白质表达变化的筛选；7. 在国际主流期刊发表高质量论文60-80 篇，申请国内外专利 10-15 项，申报国家奖励2-4项。三、研究方案总体研究方案（一）学术思路：以花生四烯酸代谢为中心，以代谢产物和相关蛋白质相互作用和调节为主轴,针对它们在重要病理生理过程中的调节作用，运用现代生物学（组学、结构生物学、生物信息学）和模式动物结合的方法展开研究。在总体研究方案有如下几个层面：1、在课题的选择上，我们选择花生四烯酸这一分布广泛、其代谢产物复杂且有重要生理病理作用，但作用机制还远未阐明的小分子化合物为研究对象。选用现代生物学方法和转基因/基因敲除等模式动物相结合，横向研究在不同的生理、病理状态下代谢途径，内源性代谢产物的变化及与相关蛋白质相互作用机制；2、在第一个层面，我们将在三大代谢途径的代谢酶基因和几个重要的花生四烯酸代谢物的受体转基因或基因敲除的细胞模型中，研究基因和代谢产物所致的代谢组和蛋白组变化。结合模式生物学手段研究当一条通路，一个酶活性发生改变时，其他通路和酶的变化，代谢产物的稳态的改变以及整体代谢组改变。以期发现代谢产物与相关酶的相互作用，以及代谢产物在重要生物调控网络中的作用及其机制。3、在第二个层面，研究花生四烯酸代谢产物与受体及转录因子等相关蛋白的相互作用机制和调控功能。重点研究不同的代谢产物对代谢性核受体重要信号转导途径的调控作用及其空间结构和生物学功能的影响；同时研究与糖、脂代谢调控相关的代谢性核受体和转录因子等对花生四烯酸代谢的调控机制。4、在第三个层面，研究花生四烯酸三条代谢途径的代谢酶和主要代谢产物在细胞增殖与分化、细胞激活和炎症、糖脂代谢紊乱等重要的病理生理过程中的作用。以心血管系统改变为代表，利用重大疾病如高血压、动脉粥样硬化、糖脂代谢紊乱和心力衰竭等疾病的动物模型和细胞模型，研究发生这些效应的同时蛋白质组和代谢组的变化规律。（二）总体技术路线按照上述总体思路，本项目利用多种模式动物研究不同基因缺陷和高表达增强后的表型变化。首先在细胞水平通过高表达或沉默相关基因及直接加入相关代谢物（如PGE2,HETEs,EETs等）验证实验结果并进行机制研究；进而进行基因组、蛋白组学研究和机制研究，明确重要蛋白在整个组学变化中的位置、调节作用和作用机制；然后是研究主要花生四烯酸代谢物在重要疾病中的病理生理作用，确定关键作用靶点。具体用以下模式图表示。图2.总体技术路线（三）研究特色和创新性1、凝练出明确的科学问题和研究思路-以花生四烯酸通路为主轴，将花生四烯酸代谢作为一个整体进行研究：本项目首次将花生四烯酸代谢产物这一作为体内多种小分子活性物质的前体物质、在生物体内广泛存在且含量丰富的物质作为一个整体进行研究。与目前的单一产物，单一酶和单一通路研究不同，我们利用组学分析和生物信息学方法主要研究三条通路间的交互作用、三条代谢通路间的平衡与调节； 2、跨学科整合，优势互补、组学研究与模式动物结合：本项目的研究人员由高校长期从事花生四烯酸代谢与疾病研究的教授和科学院具有代谢组学和结构生物学研究经验的专家组成。研究队伍具有明显的优势互补性。研究将利用先进的技术手段，包括高通量基因和蛋白质芯片技术、蛋白组学技术、代谢组学和生物信息学技术和各种模式动物，这将大大提高工作效率和获得更多、更可靠的信息；对代谢性核受体和转录因子的结构生物学研究不仅可以揭示蛋白质的功能和作用机制，而且可以为设计活性小分子作为激活剂和抑制剂提供理论依据；3、探索新的研究模式与建立新的技术平台系统：因为花生四烯酸代谢产物既能够调控代谢性核受体和转录因子的生物学功能，反过来又是代谢性核受体和转录因子所调控酶的底物或产物，因此它们之间的相互作用是一种典型的反馈调控模式。本项目将动态而全面的研究蛋白质与代谢产物的相互作用。采用上述多种新的技术和模式动物对花生四烯酸代谢产物效应进行立体的研究和发掘、全方位研究其引起的蛋白质组学变化、在网络调节中的作用；分析这些代谢产物并发现新的产物及其靶分子，研究相关作用机制，确定其在网络调节中的位置和发现关键环节；4、研究内容明确，各课题组间关系密切、分工协作：由于花生四烯酸代谢物有共同和基本的结构，不同的课题组研究的分子效应和靶点可能交叉融合，因而能获得更全面和准确的信息。项目利用已经建立的基因和蛋白质组学技术平台进行，各课题之间紧密协调进行。如课题1重点利用组学平台研究花生四烯酸代谢产物的网络调控，但研究有赖于其他课题的模式动物，而发现的新信息和分子在其他的课题组进行深入的功能研究。课题2介于课题1和课题3、4之间，重点研究代谢产物与相关蛋白的关系，为课题3和4的机制研究提供蛋白质靶点。而课题3和4分别以疾病模型研究花生四烯酸代谢产物在细胞增殖与分化，炎症与抗炎中的作用，功能性研究结果将不断提供新的内容在组学平台进行分析。另外，我们将建立的花生四烯酸代谢特异性基因芯片和蛋白质芯片为各课题组的相关研究提供筛选平台。 （四）取得重大突破的可行性分析如果本项目获得资助，我们有望在前列腺素受体（4个受体）通路、CYP-EETs -sEH代谢等方面在不同器官和细胞的作用靶点（受体和关键分子）和代谢性核受体的相互作用、对不同细胞信号系统的调节作用和作用机制、在网络调节中的作用和位置等方面取得重要成就和突破；在几个重要疾病模型（高血压、心肌肥厚、动脉粥样硬化等）中的病理作用等方面取得突破。理由如下：（1）国内已经形成了包括本项目组主要成员在内的以花生四烯酸代谢为主要研究方向的队伍。在科技部和国家自然科学基金委的资助下，近年来新近回国的一批该领域相关的科学家已经在国内做出了显著的成绩，建立起了相关研究平台和队伍，并开始发表高水平的系统研究成果，为本项目奠定了坚实基础；（2）本项目的团队有很好的学科交叉和优势互补。除了聚集了国内在花生四烯酸代谢方面有很强研究背景的项目负责人和优秀的骨干力量外，我们团队还包括在蛋白质组学和代谢组学研究方面的优秀团队，用新的思维和新的研究模式对花生四烯酸代谢与重要生理病理过程展开全面研究。（3）本项目承担单位具有良好的蛋白组学平台和工作经验，并包括了波谱与原子分子物理国家重点实验室已建立的代谢组核磁共振技术平台。我们还拥有研究所需的包括几十种转基因和基因敲除（含器官选择性的）实验动物模型，为我们工作的顺利开展提供了必要条件。（4）从前期工作基础看，本项目各课题组均有自己特色的系列工作基础，研究工作已形成完整的系统并具有原创性突破。在我们课题组成员之间已经展开了密切的合作，如管又飞与唐惠儒之间已经就基因敲除小鼠的代谢组改变正在进行合作研究。（5）本项目的主要研究内容均是在原有的独立原创工作的基础上的延伸，例如首次用前列腺素E2受体转基因和敲除动物的研究、关于CYP-EETs与高血压、心肌肥厚及动脉粥样硬化的研究等。如能整合大家的力量和学科交叉的优势，针对我们凝练的科学问题，集中精力攻克难关，我们有理由相信在花生四烯酸代谢领域能够取得重要成就和突破性进展。课题分解(一)课题设置：课题一、花生四烯酸网络调控及其代谢组学研究主要承担单位：中国科学院上海生命科学院、中国科学院武汉物理与数学研究所课题负责人：沈 旭，45岁，研究员，博士生导师，上海生命科学院药物所主要学术骨干：唐惠儒，43岁，研究员，博士生导师，中科院武汉物理与数学研究所研究内容：综合应用代谢组学、蛋白质组学、结构生物学等方法和技术研究在不同生理、病理状态下花生四烯酸不同代谢途径及其代谢产物的调节、代谢产物EETs，PGE2和各种HETE等与相关代谢酶和受体的相互作用，及其在重要生物调控网络中的作用途径及其机制。（1）发展和完善适合本项目研究的代谢组分析技术，发现新的花生四烯酸代谢产物、新的作用靶点及其与靶分子的作用关系和调控机制；（2）不同代谢途径之间，与相关蛋白酶和受体的相互作用及其机制；（3）花生四烯酸代谢产物在重要生物调控网络中的作用及其机制；（4）运用模式动物及细胞通过干扰不同代谢环节，研究花生四烯酸代谢调节整体代谢组的变化规律，发现相关的代谢标志物和代谢途径。（5）用X-衍射或NMR方法测定花生四烯酸代谢产物与结合蛋白质复合物的三维结构，研究内源产物与蛋白质的相互作用方式和位点。 预期目标：1）阐明干预花生四烯酸代谢通路引起的代谢产物的相互消长关系、调节网络和其介导的主要病理生理学功能；2）以花生四烯酸代谢产物为探针分子筛选候选作用蛋白,研究它们在相关疾病发生的新信号转导及分子调控通路，为发现具有潜在应用价值的药物靶点奠定基础；3）利用一系列生物化学和生物物理方法，形成具有原创能力的花生四烯酸代谢产物调控作用机制的研究平台；4）发现8-10个重要的调节或功能蛋白，选择研究和阐明其中有重要意义蛋白的作用和在调节网络中的作用和位置；5）在国际主流学术期刊上发表高质量研究论文 15-20篇，申请专利3-5项；6）完善和加强代谢组学技术平台，建立一支具有原创能力的化学生物学研究队伍，培养博士生6人、博士后2人。经费比例：21.4%课题二、花生四烯酸代谢产物与糖、脂代谢相关的核受体和转录因子的相互作用承担单位：中国科学院上海生命科学院、北京大学医学部课题负责人：应 浩 35 岁，研究员，博士生导师，上海生命科学院主要学术骨干：郭非凡 41岁，研究员，博士生导师，上海生命科学院向 嵩 35岁，研究员，博士生导师，上海生命科学院汪南平 46岁，教授，博士生导师，北京大学研究内容：本课题研究探索在糖、脂代谢调控中，花生四烯酸代谢产物与代谢性核受体以及相关转录因子相互作用机制及调控功能，包括（1）不同的花生四烯酸代谢产物对代谢性核受体空间结构以及生物学功能的影响；（2）代谢性核受体和转录因子对花生四烯酸代谢途径的调控机制；（3）花生四烯酸代谢产物在代谢性核受体和转录因子调控的糖、脂代谢中的功能及作用机制；（4）花生四烯酸代谢在糖、脂代谢和重大代谢性疾病发生发展中的变化规律、影响因素和作用机理。预期目标：1、针对花生四烯酸代谢产物对糖、脂代谢的功能调控，系统研究参与花生四烯酸代谢途径的关键调控蛋白质，特别是代谢性核受体PPAR和转录因子SREBP-1的生理功能；2、研究花生四烯酸代谢产物与关键蛋白质的相互作用机制及其所调控网络，并探索花生四烯酸代谢产物在糖、脂代谢过程中的生物学功能和在重大代谢性疾病发生发展中的病理学意义。3、针对花生四烯酸代谢相关的酶、受体、作用靶点，建立专门的蛋白质芯片，用于模式动物和细胞蛋白质表达变化的筛选，并为其他课题组提供平台；4、发现8-10个重要的调节或功能蛋白，选择研究和阐明其中有重要意义蛋白的作用和在调节网络中的作用和位置；5、在国际主流学术期刊上发表高质量研究论文 15-20篇，申请专利3-5项；6、建立一支具有原创能力的分子生物学研究队伍，培养博士生6-8人、博士后2人。经费比例：22.6%课题三、花生四烯酸代谢产物与炎症调控和动脉粥样硬化发病机制承担单位：汕头大学、北京大学医学部课题负责人：周应毕 48 岁，教授，博士生导师，汕头大学主要学术骨干：管又飞 44岁，教授，博士生导师，北京大学黄东阳 52 岁，教授，博士生导师，汕头大学罗文鸿 45岁，教授，博士生导师，汕头大学研究内容：本课题组利用我们已拥有的多种花生四烯酸相关基因敲除和转基因小鼠，应用分子生物学、细胞生物学、代谢组学、蛋白质组学、以及病理生理方法和手段研究：（1）在炎症过程中花生四烯酸不同代谢途径中的变化规律，及它们对血管功能影响和机制；（2）花生四烯酸重要代谢产物的产生、降解在炎症过程中的病理生理作用；（3）花生四烯酸代谢通路及其代谢产物在动脉粥样硬化发生、发展及治疗中的作用；（4）COX、LOX及其前列腺素合酶和受体基因敲除和活性抑制对花生四烯酸代谢组的影响以及对其他途径产物的调节作用。预期目标：1、明确在炎症过程中花生四烯酸不同代谢途径中的变化规律，花生四烯酸重要代谢产物的产生、降解在炎症过程中对整体动物和细胞的病理生理作用以及它们对血管功能的影响和机制；2、阐明花生四烯酸代谢通路及其代谢产物在动脉粥样硬化发生、发展及治疗中的作用及其分子机制。3、研究阐明花生四烯酸COX、LOX及其前列腺素合酶和受体基因敲除和活性抑制对花生四烯酸代谢组的影响以及对其他代谢产物的调节作用。研究它们在不同器官和组织所致的基因表达谱和蛋白组的变化，明确这些组学变化与心血管细胞功能改变的关系。4、完善花生四烯酸代谢相关的转基因小鼠和组织特异性基因敲除小鼠等模式动物平台；运用5-10种代谢物受体转基因或基因敲除动物，完成在非干预状态下和不同干预状态下重要组织器官基因表达谱和蛋白组学研究。5、在国际主流学术期刊上发表高质量研究论文 15-20篇，申请专利3-5项。6、培养博士生6-8人、博士后2人。经费比例：22.6%课题四、花生四烯酸代谢产物对细胞增殖与分化调控机制及其在心血管损伤与重塑中的作用 主要承担单位：北京大学课题负责人：朱 毅 49 岁，教授，博士生导师，北京大学主要学术骨干：王 宪 53 岁，教授，博士生导师，北京大学祝世功 53 岁，教授，博士生导师，北京大学郑乐民 35 岁，副教授，硕士生导师，北京大学研究内容以心血管损伤与重塑为切入点，研究花生四烯酸代谢产物对细胞增殖与分化调控机制（1）不同代谢途径中的产物对细胞增殖与分化调控机制；（2）不同代谢途径中的产物对心血管细胞的损伤与保护机制；（3）在心血管重塑过程中不同代谢途径中产物的变化规律及其病理生理作用；（4）CYP2C44、CYP2J5和sEH基因缺陷小鼠心血管细胞的蛋白质组和代谢组变化规律。预期目标：1、初步明确不同花生四烯酸代谢途径中的产物对细胞增殖与分化的调控以及对心血管细胞的损伤与保护机制；阐明在心血管重塑过程中花生四烯酸不同代谢途径中产物的变化规律及其病理生理作用；2、阐明花生四烯酸代谢通路和代谢物在具有共同的病理生理过程的高血压、血管再狭窄和心衰等重大心血管疾病中的作用和机制，明确数个可能通过分子特异性干预达到抑制或阻断疾病发生、发展的靶点；3、运用CYP2C44、CYP2J5和sEH基因缺陷小鼠，研究CYP通路在心血管细胞的蛋白质组和代谢组变化规律；4、针对花生四烯酸代谢相关的酶、受体、作用靶点，建立专门的基因芯片，用于模式动物和细胞基因表达变化的筛选，并为其他课题组提供平台； 5、在国际主流学术期刊上发表高质量研究论文 15-20篇，申请专利3-5项；6、培养博士生6-8人、博士后2人。经费比例：33.4%（二）课题设置的思路及各课题间的有机联系围绕要解决的关键科学问题、主要研究内容和预期目标，我们以花生四烯酸代谢为中心，以代谢产物与相关蛋白相互作用和调节为主轴,针对它们在重要生理及病理生理过程中的调节作用，设置4个课题。课题设置思路及与其它课题的关系分析如下：课题1将以花生四烯酸代谢组改变及其网络调控研究为重点；利用项目组成员已拥有的各种转基因和基因敲除小鼠，研究各个通路改变而引起的其他产物的消长以及整体代谢组变化，而发现的新信息和分子将在其他的课题组进行深入的功能研究。是本项目代谢组研究的重要平台。课题2重点研究不同的代谢产物对相关蛋白，主要是糖、脂代谢相关的代谢性核受体和转录因子调控作用及其空间结构和生物学功能的影响；同时，研究这些核受体和转录因子对花生四烯酸代谢的调控机制。该课题介于课题1代谢组学研究和课题3、4的各种疾病模型之间，为其他课题的研究提供蛋白质靶点，研究相关蛋白质的重要生理和病理作用。同时，建立花生四烯酸代谢特异性蛋白质芯片，为各课题组的相关研究提供筛选平台。课题3主要针对花生四烯酸不同代谢途径中的代谢产物对以动脉粥样硬化为代表的慢性炎症的调控机制展开研究；同时重点研究COX和LOX酶及代谢产物对病变血管组织的细胞功能调节，以及它们与其他途径产物的关联作用。是本项目重要的模型动物平台。一方面为各课题组提供各种相关模型动物，承担其他课题中与炎症、细胞激活相关的功能试验，另一方面依靠其他课题组的代谢组学和蛋白结构生物学分析平台。课题4主要针对花生四烯酸不同代谢途径中的代谢产物对以高血压、心血管损伤与重构为代表的细胞增殖与分化的调控机制展开研究；同时研究CYP酶和代谢产物EETs的产生、降解的调节以及对其他途径产物的调节作用。同时将建立花生四烯酸代谢特异性基因芯片，为各课题组的相关研究提供相关基因的筛选平台。该课题依靠其他课题组的代谢组学、蛋白质结构生物学分析和模式动物平台，同时承担其他课题中与心血管系统细胞增殖与分化相关的功能试验。图3. 课题设置思路及与其它课题的关系四、年度计划第一年度：研究内容：1. 花生四烯酸代谢产物结合蛋白质的发现与确证：（1）应用反向对接技术从蛋白质数据库中或利用受体垂钓技术从细胞匀浆中搜寻可能与花生四烯酸代谢产物结合的新的候选蛋白质。（2）表达候选蛋白质，利用生物物理学、分子细胞生物学及生化技术验证花生四烯酸代谢产物与候选蛋白质的相互作用及探讨它们之间的作用机制。2. 代谢性核受体为中心的蛋白的表达、蛋白纯化和结晶：运用生物信息学手段预测并选取57个在基因调控过程中起重要作用的蛋白或复合体作为研究对象，构建蛋白或复合体表达质粒。测试相关蛋白是否表达和可溶，测试它们在溶液中能否形成分子量均一的单体或多聚体。优化纯化流程，获得高纯度蛋白，开始结晶条件的优化工作。3. 糖、脂代谢动物模型的建立和多种组学分析：运用生物信息学手段预测并确定34个相关核受体和转录因子小鼠模型作为研究花生四烯酸代谢调控的平台，扩展小鼠种群，收集糖脂代谢相关的组织，然后进行代谢组学分析和基因组学等分析。在体内和体外，运用细胞和动物模型，检测各种花生四烯酸代谢产物对糖、脂代谢的影响，寻找可以通过核受体或转录因子起的作用的关键花生四烯酸代谢产物。4. 炎性因子对花生四烯酸三大代谢通路合成酶及产物影响：通过对细胞进行炎性因子刺激，确定此过程对花生四烯酸三大代谢通路关键合成酶的成酶谱表达及代谢铺的影响。并研究单一代谢通路阻断对细胞炎症反应的影响，观察它们对促炎和抗炎各种信号传导通路的影响。5. COX通路与动脉粥样硬化发生、发展的关系：检测人和动物动脉粥样硬化斑块COX的表达水平以及代谢产物的种类和水平外，并将制备COX通路关键酶和受体基因缺陷的动脉粥样硬化小鼠，研究COX通路及其产物对动脉粥样硬化发生的影响。 6. 研究血管平滑肌细胞表形转化，和心肌细胞、免疫细胞等在各种诱导下，功能改变过程中花生四烯酸代谢途径相关酶及代谢产物谱改变；明确变化的代谢产物与诱导的细胞功能变化的关系。 7. CYP通路基因敲除小鼠心血管细胞的蛋白质组和代谢组变化规律：利用代谢组学手段开始研究不同的CYP酶和EET水解酶基因敲除的血管内皮细胞、平滑肌细胞和心肌细胞中花生四烯酸代谢谱的改变。并且利用腺病毒高表达或特异性抑制剂干预EET的产生和降解对其它代谢途径的影响，并明确不同CYP450同功酶花生四烯酸代谢产物的异同。8. 建立核磁共振技术为基础的动物微量体液和组织代谢组表征技术:（1）建立适合基因敲除动物研究的微量动物体液代谢组定量检测方法。（2）建立基于“魔角旋转”核磁共振（HRMAS-NMR）技术的细胞和组织代谢组原位分析新方法。9. 开始针对花生四烯酸代谢相关的酶、受体、作用靶点，设计专门的基因芯片和蛋白芯片，逐步建立用于模式动物和细胞基因表达变化的筛选，并为项目的实施提供平台。预期目标：1. 找到与花生四烯酸代谢产物结合的新的候选蛋白3-5个，并进一步确证它们之间的作用及阐述相应的作用机制。2. 得到12个可溶的，高纯度的蛋白，得到初步的蛋白结晶条件，建立相关研究蛋白功能的手段。3. 发现25个可能通过核受体或转录因子调控糖、脂代谢的花生四烯酸代谢产物。初步探讨糖、脂代谢紊乱影响花生四烯酸代谢相关核受体的表达及转录的新规律。4. 在细胞水平确定在不同细胞的炎症反应、及抗炎过程中起关键作用的花生四烯酸代谢酶系和产物，并推测出其相应的可能作用靶点。5. 确定动脉粥样硬化斑块COX及PGE2的表达及代谢产物，建立双基因敲除小鼠，阐明COX1、COX2及PGE2在动脉粥样硬化发生、发展中的作用；以及COX通路产物对血管内皮细胞、平滑肌细胞及单核巨噬细胞功能的影响。6. 找到血管平滑肌表形转化、心肌细胞、免疫细胞等功能改变与花生四烯酸代谢产物相关的新候选蛋白3-5个，并进一步确证变化的代谢产物与诱导的细胞表型改变的关系及其机制。逐步明确变化的代谢产物与诱导的细胞表型及功能变化的关系及其机制。7. 完成利用腺病毒高表达或特异性抑制剂干预EET的产生和降解在心血管细胞对其它代谢途径的影响，并明确不同CYP450同功酶花生四烯酸代谢产物的异同。初步完成CYP通路基因sEH敲除小鼠心血管细胞的蛋白质组和代谢组的检测工作。8. 建立三大代谢通路的各种产物检测方法，并确定多种类型细胞（包括血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞和炎症相关细胞等）在各种炎症因子和细胞因子的刺激下花生四烯酸三大代谢通路关键合成酶的蛋白表达及产物构成和水平。9. 建立适合基因敲除动物研究的微量动物体液代谢组的超灵敏核磁共振定量检测方法，解决检测灵敏度提高、波谱基线的平整、定量和水峰掩盖的信号获取等问题。建立细胞和生物组织代谢组高分辨核磁共振原位定量分析新方法。10. 建立用于模式动物和细胞基因表达变化的专门的基因芯片，并为项目的实施提供平台.11. 开始在国际主流学术期刊上发表高质量研究论文 4-6篇。第二年度：研究内容：1. 在上一年研究工作的基础上，开展进一步的质粒的构建与优化、蛋白的纯化、结晶和功能研究等工作。培养花生四烯酸代谢产物与结合蛋白质的复合物晶体，用X-衍射或NMR方法，测定复合物的三维结构。对于可以获得的高纯度蛋白，根据它们的功能建立研究它们活性的生化和细胞实验，测量获得的蛋白是否具有相关的活性。扩展研究的范围，增加57个新颖的有重要功能的蛋白。2. 应用蛋白质蛋白质相互作用网络预测方法预测与花生四烯酸相互作用蛋白质相关的蛋白质作用网络，结合生物信息学分析，获得与花生四烯酸代谢产物相关网路或通路信息。3. 基于糖、脂代谢动物模型的多种组学研究：通过对小鼠样本的代谢组学的结果分析，寻找受核受体和转录因子调控的花生四烯酸代谢途径；同时分析基因组学和蛋白质组学结果来寻找花生四烯酸代谢途径中受核受体和转录因子调控的酶；比较多种核受体异构体突变小鼠的代谢谱，表达谱和特异性。 4. 关键花生四烯酸代谢产物调控糖、脂代谢的分子机制：结合多种与糖、脂代谢相关的在体和离体模型，从转录调控水平和信号转导水平寻找花生四烯酸代谢产物调控糖、脂代谢的分子机理，特别是一些转录后调控机制。5. 代谢性核受体、转录因子与花生四烯酸代谢：观察炎症状况下，以PPARs和LXRs为代表的代谢性核受体及以NF-kB，AP-1为代表的炎性反应转录因子的变化并观察其阻断后代谢酶学与前列腺素、EETs和白三烯的变化。6. LOX通路在动脉粥样硬化发生中的作用：检测动脉粥样硬化斑块LOX的表达及代谢产物；观察不同LOX抑制剂和LOX基因敲除对动脉粥样硬化小鼠（apoE-/-和LDLR-/-）发生、发展的影响；检测白三烯、12-HETE和15-HETE对血管内皮、平滑肌及单核巨噬细胞功能的影响及其机制；7. 深入研究COX-1和COX-2对代谢组学的影响：检测COX-1和COX-2基因敲除及双基因敲除和活性阻断动物重要组织、血液和尿液代谢组的变化并与同基因背景的野生型小鼠比较。8. 用蛋白组学和基因组学方法研究导致炎症、动脉粥样硬化和心血管重塑过程中基因表达谱的变化，找出关键分子并研究其作用机制、相关的伴随分子及其相互作用。同时运用代谢组学方法研究花生四烯酸代谢途径的干预引起的代谢产物谱改变，明确变化的代谢产物与诱导的细胞激活、功能变化和表形转化的关系。9. CYP单氧酶与细胞生长及分化的关系：重点研究在心血管细胞中白三烯、12-HETE和15-HETE对细胞功能的影响及其机制；CYP、w-羟化酶以及EET的水解酶sEH对细胞炎症反应、激活、增殖和分化的影响；在CYP基因敲除小鼠分离的细胞中，各种促进细胞增殖或分化的刺激物或通路的变化及对细胞主要生理功能的影响。10. 运用已有的CYP通路基因敲除小鼠（CYP2C44、CYP2J5和sEH），建立球囊拉伤内膜增生模型和高血压、心肌肥厚模型，在体研究花生四烯酸代谢紊乱与心血管功能异常的关系。11. 用蛋白组学和基因组学方法研究花生四烯酸代谢物导致内皮激活与保护的特性改变的基因表达谱变化：寻找关键分子并研究其作用机制、相关的伴随分子及其相互作用。根据内皮的功能特性，进行相关功能试验。12. 建立优势集成的代谢组分析新方法：(1)发展用于生物体液代谢组分析的LC-NMR-MS和NMR-MS新方法。(2)建立基于LC-DAD-SPE-NMR-MS联用的代谢物定性和结构鉴定方法。预期目标：1. 获得花生四烯酸与蛋白的复合物晶体结构及12个可溶的，高纯度的蛋白，得到初步的蛋白结晶条件，建立相关研究蛋白功能的手段，获得12个蛋白的高质量的晶体（衍射到3埃或更好）。2. 预测出花生四烯酸代谢产物参与的调控网络或新的信号通路；揭示受核受体和转录因子调控的花生四烯酸代谢途径，发现24个相应调控点（调控蛋白），确定其在调控网络中的位置。12个重要信号转导途径，以及相应的分子机制。3. 建立核受体调控花生四烯酸代谢相关蛋白的表达谱，调控花生四烯酸代谢的代谢产物谱，确定2-3个可能干预靶点。确证24个介导花生四烯酸代谢产物调控糖、脂代谢和炎症的关键调控蛋白。4. 阐明5-LOX、15-LOX对动脉粥样硬化发生、发展的影响及相互作用与机制；明确白三烯、12-HETE和15-HETE对血管内皮、平滑肌及单核巨噬细胞等功能的影响及其机制。5. 确定COX-1和COX-2及双基因敲除对各重要脏器、组织、血液和尿液花生四烯酸代谢组的影响。明确在心血管炎症和重塑过程中基因表达谱的变化，找出4-8个关键分子并研究其作用机制、相关的伴随分子及其相互作用6. 完成CYP通路基因敲除小鼠血管内膜激活、高血压和心肌肥厚模型的建立，并在体研究CYP通路与心血管重塑的关系。完成CYP通路中其他基因包括CYP、w-羟化酶敲除小鼠心血管细胞及免疫细胞的蛋白质组和代谢组的检测工作。明确在心血管细胞中CYP单氧酶与细胞生理和病理生理功能的关系。7. 完成小鼠血管内皮细胞的分离培养及用蛋白组学和基因组学方法研究花生四烯酸代谢物导致内皮激活与保护的特性改变的基因表达谱变化，找出2-3个关键分子并研究其作用机制。8. 建立用于生物体液代谢组分析的LC-NMR-MS、NMR-MS等新方法和代谢物快速定性和结构鉴定的LC-DAD-SPE-NMR-MS新方法。 9. 初步建立特异花生四烯酸代谢通路相关的蛋白芯片。10. 整理数据、在国际主流学术期刊上发表高质量研究论文 10-15篇，申请专利24项。第三年度：研究内容：1. 关键蛋白质的结构功能研究：包括对重要的突变体的结构和功能的研究，对重要的底物或抑制物、激活因子的复合体的结构研究等。根据课题进展，扩展研究的范围，增加57个新的花生四烯酸代谢相关的蛋白。2. 对发现的新的关键调控蛋白质进行深入研究：建立细胞模型，对发现的参与核受体及转录因子调控花生四烯酸代谢的调控蛋白质包括核受体转录因子以及相关的辅助因子进行生物学功能深入分析。3. 花生四烯酸代谢产物相关网路或通路的功能确证：（1）利用分子、细胞生物学的技术手段对预测出来的花生四烯酸参与的调控网络或信号通路的进行功能确证；（2）在动物水平对预测出来的花生四烯酸参与的调控网络或信号通路的进行功能确证。4. 利用核受体转录因子转基因和基因敲除小鼠观察特定花生四烯酸代谢通路对包括2型糖尿病、动脉粥样硬化和心肌肥厚等小鼠病理过程发生和转归的影响。5. 重点研究PPAR系列基因的改变对动物体液和组织代谢组的影响规律：(1) 研究PPARg、PPARa、PPARd等基因敲除动物尿液和血浆代谢组变化规律，确定代谢标志物结构。(2) 原位分析PPARg、PPARa、PPARd等基因敲除动物相关组织代谢组变化规律，确定相关代谢标志物结构。6. 研究单一花生四烯酸代谢通路阻断对重要脏器和组织炎症反应的影响：通过炎性因子腹腔注射，诱发全身炎症，观察各关键酶基因缺陷或药物抑制时不同脏器和组织炎症反应与功能变化。同时观察单一通路阻断的情况下前列腺素、EETs和白三烯彼此的消长关系与代谢产物改变。7. CYP通路与动脉粥样硬化发生的关系：检测动脉粥样斑块CYP和w-羟化酶的表达及其产物水平的改变；观察各种EET产生和降解酶对apoE-/-和LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化的发生和发展；观察小鼠病理过程发生和转归的影响。8. 继续前一年有关内皮功能方面的研究，运用蛋白组学和基因组学方法研究花生四烯酸代谢物导致内皮激活与保护的特性改变的基因表达谱变化，寻找关键分子并研究其作用机制、相关的伴随分子及其相互作用。整合分析基因组、蛋白质组、代谢组和结构生物学并结合代谢通路，研究发现相关代谢标志物及其功能。9. 深入研究COX-1和COX-2对代谢组学的影响：通过干预动物COX-1、COX-2表达，研究重要组织、血液和尿液代谢组及其花生四烯酸代谢谱改变。研究同的类型的细胞中COX通路代谢产物对细胞增殖和分化的影响。使用COX通路中关键合成酶的表达质粒或腺病毒、基因敲低或活性改变，观察花生四烯酸代谢产物谱的改变及对细胞周期和分化指标的影响和机制。10. 在细胞水平研究LOX途径主要代谢产物对细胞增殖和分化的影响：使用LOX通路中关键合成酶（5-LOX、12-LOX、15-LOX）的表达质粒或腺病毒、基因敲低或活性抑制，观察花生四烯酸代谢产物谱的改变及对细胞周期和分化指标的影响并探讨变化的分子基础；白三烯（LTs）、12-HETE和15-HETE调节细胞增殖与分化的机制。预期目标：1. 确证花生四烯酸代谢产物参与的新的调控网络或信号通路，并阐述不同信号通络的相互关联。2. 获得花生四烯酸代谢产物参与的信号通路中的关键蛋白的复合物晶体结构。获得12个蛋白的高质量的晶体（衍射到3埃或更好）。根据结构理解蛋白的相关功能，在结构数据的指导下，通过引入突变等手段来影响和研究蛋白的功能，深入理解功能的机理。3. 完成PPARg等基因敲除动物的尿液和血浆代谢组变化规律分析和相关组织代谢组变化规律分析，确定代谢标志物的结构。 4. 发现23个花生四烯酸代谢通路影响2型糖尿病、动脉粥样硬化和心肌肥厚等疾病的新规律和新机制。获得基于新的信号通路或新的靶标的活性化合物5-10个。研究23个参与核受体和转录因子调控花生四烯酸代谢的调控蛋白，揭示相应的分子调控机制，以及代谢改变的关系。5. 确定心血管系统炎性病变时花生四烯酸代谢的关键酶学与代谢产物改变与作用机制，及其可能干预靶点。确定在特定细胞模型中花生四烯酸代谢途径的亚通路的抗炎与促炎的主要因素及其机制，并设计出相应的干预靶点。6. 确证花生四烯酸代谢物导致内皮激活与保护的特性改变的基因表达谱，选择3-5个关键分子并研究其作用机制、伴随分子及其相互作用。确定CYP及产物在动脉粥样斑块内改变，阐明CYP通路及产物在动脉粥样斑块发病中的作用与机制7. 完成COX通路代谢产物对细胞增殖和分化的影响，完成COX1和COX2基因敲除小鼠整体代谢组以及特定心血管细胞的代谢组学研究。发现相关分子2-3个并在不同细胞中验证它们与细胞增殖和分化的关系，并揭示其分子机制。8. 完成LOX途径主要代谢产物，尤其是白三烯、12-HETE和15-HETE对细胞增殖和分化的影响及其机制的相关研究。逐步明确变化的代谢组改变与蛋白质组、基因组学变化的关系。9. 完成动物代谢组与蛋白质组及有关数据的整合分析，研究相关代谢标志物的功能。10. 在国际主流学术期刊上发表研究论文 15-20篇。申请专利35项。第四年度：研究内容：1. 优化结晶的条件，对高质量的晶体进行衍射数据的采集、结构解析、分析等工作。表达所发现的花生四烯酸代谢产物参与的信号转导通路中的关键蛋白质，培养通路中蛋白与蛋白的复合物晶体，用X-衍射或NMR技术，测定复合物的三维结构。根据课题进展，扩展研究的范围，增加57个新发现的，在花生四烯酸代谢中有重要功能的蛋白。2. 利用生物大分子相互作用分析仪对不同代谢性核受体进行配体垂钓，寻找可以作为代谢性核受体配体或影响代谢性核受体与配体结合的花生四烯酸代谢产物，发现新的具有调控功能的花生四烯酸代谢产物。在细胞水平和组织器官水平，对该新的代谢产物进行功能分析。3. 根据已确证的信号转导通路或确证靶标的信息，利用虚拟筛选或者高通量筛选方法筛选活性化合物。4. 利用花生四烯酸代谢通路限速酶基因敲除小鼠研究PPARs等代谢性核受体对心血管作用的分子代谢机制。5. 研究在局部组织、器官炎症状态下，单一花生四烯酸代谢通路阻断对神经体液因子调节血管功能的影响及机制。在整体动物水平，运用各种关键酶基因缺陷小鼠，研究全身炎症反应状态下，单一花生四烯酸代谢通路阻断对炎症介质和主要脏器和组织炎症反应的影响。6. 花生四烯酸双代谢通路阻断剂对动脉粥样硬化、高血压和心肌肥厚等重大心血管疾病发生、发展的影响：使用5-LOX和COX-2双阻断剂licofelone处理apoE-/-和LDLR-/-小鼠，观察其对动脉粥样硬化斑块的影响并研究其机制。7. LOX-5和12/15-LOX等基因敲除动物的代谢组学研究：检测5-LOX-/- 小鼠和15-LOX1-/-小鼠及5-LOX抑制剂和15-LOX抑制剂抑制小鼠重要组织和体液花生四烯酸代谢谱改变8. COX代谢产物PGE2受体基因EP1-4的改变对动物体液和组织代谢组的影响规律：系统研究EP1-4等基因敲除动物体液（尿液和血浆）代谢组变化规律，确定相关代谢标志物的结构。原位分析EP1-4基因敲除动物的相关组织代谢组变化规律，确定相关代谢标志物的结构。集中研究缺陷小鼠对水盐代谢及血压的影响。9. 重点研究EP3受体基因敲除小鼠对水钠内环境稳态及正常血压维持的作用。通过比较野生型和EP3-/-小鼠尿量、尿钠排泄和基础血压的改变，以及对缩血管药物全身给药的不同反应，揭示EP3受体在血压调节中的功能。10. 利用EP4受体基因组织特异性基因敲除技术，选择性的敲除血管内皮细胞和平滑肌细胞的EP4受体，观察对药物缩血管作用的反应，以阐明血管组织EP4受体在调节血管舒张功能中的作用；利用EP4受体基因组织特异性基因敲除技术，选择性的敲除肾脏EP4受体，观察肾脏EP4在介导PGE2利尿、利钠等功能中的作用。11. 研究主要免疫系统主要是B细胞和不同亚型T细胞中不同EP受体对免疫功能及对心血管疾病的