生物参数检测与控制 2化学分析

三 含氮量的测定氮是发酵微生物所必须的氮源 原料中蛋白质含量的高低对发酵制品的质量关系很大 如啤酒酿造中 原料中蛋白质含量过高 往往能造成啤酒浑浊 但对酱油等发酵食品讲 则需选用蛋白质含量较高的原料 对酵母讲 含氮量则是酵母成品质量的一个重要指标 一 原料中粗蛋白质的测定1 原理蛋白质测定常采用凯氏定氮法 Kjeldahl 其原理是将试样与浓硫酸共热消化 使蛋白质分解 其中氮与硫酸化合生成硫酸铵 然后碱化蒸馏使氨游离 用标准酸接收 过量酸用标准碱滴定 凯氏定氮法所测得的为试样中总氮量 它除蛋白质中氮外 还包括氨基酸 酸胺 核酸等中的氮 换算成蛋白质 称为粗蛋白质 浓硫酸的作用 1 脱水使有机物炭化 2 氧化 浓硫酸在338 以上分解产生氧气 能使有机物破坏 生成二氧化碳和水 4 2NH3 H2SO4 过量 NH4 2SO4 硫酸铜的作用 催化剂 2CuSO4 Cu2SO4 SO2 O2C O2 CO2 2H2 O2 2H2O Cu2SO4 2H2SO4 2CuSO4 SO2 2H2O 硫酸钾的作用 提高沸点 K2SO4 H2SO4 2KHSO4使沸点提高到400 过氧化氢的作用 H2O2 2H 2H2OE0 1 77VO2 4H 2H2OE0 1 229V过氧化氢能力比氧强 能加速有机物分解 30 氢氧化钠的作用 NH4 2SO4 2NaOH 2NH4OH Na2SO4 蒸馏出的氨被硫酸吸收 2NH3 H2SO4 NH4 2SO4过量的硫酸用氢氧化钠滴定 H2SO4 2NaOH Na2SO4 2H2O 2 试剂 浓硫酸 硫酸钾 硫酸铜 CuSO4 5H2O 过氧化氢 30 30 氢氧化钠溶液 试剂1 28 0 1V硫酸溶液 试剂1 29 0 1N氢氧化钠溶液 试剂1 30 0 1 甲基红指示剂 试剂1 31 3 测定步骤1 试样消化 准确称取2克试样 置入250毫升凯氏定氮瓶中 加3克硫酸钾和1克硫酸铜 加20毫升浓硫酸 瓶口安放一只小三角漏斗 于电炉上加热消化 消化装置见图1 2 若消化液色泽较难褪去 则冷却后 加3 5毫升过氧化氢 继续加热 直至消化液清澈透明为止 冷却 转入100毫升容量瓶中 瓶中预先加入约20毫升水 用水充分洗涤凯氏定氮瓶 冷却至室温 再用水定容至刻度 摇匀 2 加碱蒸馏 吸取50毫升稀释消化液 置入500毫升平底烧瓶中 加约100毫升水和数粒沸石 加60毫升30 氢氧化钠溶液 或在烧瓶上安一分液漏斗加碱 立即盖严 蒸馏约45分钟 或蒸出原液体积约1 3 接收瓶中预先准确加入25或50毫升0 1N硫酸溶液 蒸馏装置见图1 3 3 滴定 蒸馏完后 用水洗涤冷凝器 取出接收瓶 加4滴0 1 甲基红指示剂 用0 1N氢氧化钠溶液滴定至黄色 4 计算 式中 NV H2SO4 接收瓶中硫酸溶液的当量浓度与体积 毫升 NV NaOH 滴定时消耗氢氧化钠溶液的当量浓度与体积 毫升 0 01401 氮的毫克当量 克 100 50 稀释倍数W 试样重量 克 式中6 25 氮与蛋白质的换算系数 5 讨论1 凯氏定氮法既适用于有机氮 又适用于无机氮 其测定范围较宽 常量法可测定约40毫克氮 而用水蒸汽蒸馏的半微量法可测定至数毫克氮 最低可检出0 05毫克氮 2 凯氏定氮法消化时 必须在通风柜中进行 开始消化时宜用文火加热 稳定后 才用强火加热 中途需摇动凯氏定氮瓶 使附在瓶壁上的黑点冲下 3 凯氏定氮法消化时催化剂也可采用汞 蒸馏时也有加数粒锌防暴沸 接收液也可采用2 4 硼酸溶液 用标准酸滴定 其指示剂为甲基红一溴甲酚绿混合指示剂 试剂1 32 终点变色敏锐 其反应式 2NH3 4H3BO3 NH4 2B4O7 5H2O NH4 2B4O7 H2SO4 5H2O NH4 2SO4 4H3BO3 4 氮与蛋白质的换算系数是由实验确定 不同原料 其蛋白质的换算系数稍有不同 蛋白质中含氮量一般在16 左右 故换算系数为 100 16 6 25 半微量定氮法 水蒸汽蒸馏法 本法的原理和测定步骤基本上与常量的凯氏法相同 所不同的是样品需要量少 几毫克固体样或几毫升液体样 适于含氮量低的试样 另外 碱化后蒸馏采用水蒸汽蒸馏法 装置 测定步骤 吸取5毫升试液于50毫升干燥的凯氏定氮瓶中 以文火浓缩成粘稠状 约1 2毫升 加1 8克混合催化剂 试剂 36 切勿粘于壁上 加5毫升浓硫酸 摇匀 瓶口加一小漏斗 以文火加热 加热时尽量避免泡沫飞溅 待泡沫停止发生后 加强火使其沸腾 硫酸在瓶中沸腾回流 其回流程度以高达瓶颈的1 3处为宜 直至消化液清澈透明 将消化液移入100毫升容量瓶中 用水定容至刻度 吸取25毫升稀释消化液 置入蒸馏器内 用20毫升2 硼酸溶液接收 加甲基红 溴甲酚绿指示剂 试剂1 32 向蒸馏器内缓慢加入15毫升30 氢氧化钠溶液 碱液流尽前 于漏斗上加少量水 当作水封 通入水蒸汽 蒸馏15分钟 让硼酸液面离开接收管再蒸2分钟 以水冲洗接收营 取下三角瓶 以0 01N的盐酸溶液滴定溶液由蓝绿色变为浅紫粉色即为终点 另做一空白试验 所耗盐酸量从样品所耗盐酸中扣除 计算 式中N 盐酸溶液的当量浓度V 消耗盐酸溶液的体积 毫升 14 01 氮的毫克当量 毫克 100 25 25为吸取稀释消化液的体积 毫升 100为消化液稀释的体积 毫升 100 5 5为吸取试液的体积 毫升 100为换算成100毫升试样中含氮量 酱油中氨态氮的测定氨基酸是酱油中重要成分之一 酱油中氨基酸是由蛋白质水解所产生 1 原理氨基酸是同时具有氨基与羧基的两性化合物 不能用氢氧化钠直接测定 而采用加入甲醛 使氨基的碱性被掩蔽 呈现羧基酸性 再以氢氧化钠滴定 反应式 2 试剂1 甲醛溶液 36 38 2 0 05N氢氧化钠溶液 试剂1 37 3 测定步骤吸取10毫升酱油 用水稀释定容至100毫升 吸取2毫升稀释液 置入100毫升烧杯中 加80毫升水 搅拌下 用0 05N氢氧化钠溶液滴定至pH8 20 用酸度计测量 此为游离酸度 不予计量 加10毫升甲醛溶液 立即用0 05N氢氧化钠溶液满定至pH9 20 用酸度计测定 另取80毫升水 不加酱油稀释液 作为空白液 同上操作 4 计算 V 加甲醛后试液消耗氢氧化钠溶液体积 毫升 V0 加甲醛后空白液消耗氢氧化钠溶液体积 毫升 N 氢氧化钠溶液的当量浓度0 01401 氮的毫克当量 克 100 2 2为吸取酱油稀释液的体积 毫升 100为酱油稀释的体积 毫升 10 吸取酱油的体积 毫升 5 讨论1 甲醛法中除氨态氮外别的氮也能起反应 故误差较大 另外由于各种氨基酸的等当点不同 故确定一个合适的滴定终点较为困难 氨态氮较为正确的测定方法宜用范斯莱克定氮法 VanSlyke N2 2 酱油色泽较深 采用指示剂方法进行滴定其误差更大 若经活性炭脱色 则许多芳香族氨基酸易被吸附 使结果偏低 四 酸的测定酸的测定不仅对微生物发酵过程中具有一定的指导意义 而且酸对产品的质量关系甚大 如酒和酒精的生产中 对麦芽计 发酵液 酒醅 固体曲 液体曲 酒母醪等中的酸都有一定的要求 发酵制品如白酒 啤酒 酱油 食醋等中的酸又是一个重要的质量指标 发酵中产生的酸类甚多 有脂肪酸 羟基酸等 其中低碳短链的直链脂肪酸 如甲酸 乙酸等称为挥发酸 而乳酸 柠檬酸等称为非挥发酸 酸的测定方法常采用中和法 也有采用电位滴定法 比色法 试液色泽很深可采用外指示剂法 酸的表示方法 常以样品中主要的酸来计算 如白酒中酸以乙酸计 食醋中非挥发酸以乳酸计 在特定的条件下 也可采用消耗氢氧化钠操作溶液的毫克当量数或体积数来表示 一 白酒中总酸 挥发酸 非挥发酸的测定1 原理白酒中总酸以中和法直接测定 挥发酸用水蒸汽蒸馏 馏出液以中和法测定 总酸与挥发酸之差即为非挥发酸 2 试剂1 0 1N氢氧化钠溶液 试剂1 30 2 0 5 酚酞指示剂 试剂1 38 3 测定步骤 总酸的测定 吸取50毫升白酒 置人500毫升三角瓶中 加100毫升水和2滴0 5 酸酞指示剂 用0 1N氢氧化钠溶液滴定至微红色 式中N V 氢氧化钠溶液的当量浓度与消耗体积 毫升 0 06006 乙酸的毫克当量 克 50 吸取酒样体积 毫升 100 换算成100毫升酒样中酸量 若以乳酸计 只需将乙酸的毫克当置换成乳酸的毫克当量 0 09008 即可 2 挥发酸的测定 吸取100毫升白酒 加100毫升水蒸馏 以100毫升容量瓶正确接收100毫升 吸取25毫升馏出液 置入100 150毫升三角瓶中 加2滴0 5 酚酞指示剂 以0 1N氢氧化钠溶液滴定至微红色 3 非挥发酸的测定 非挥发酸 以乳酸计克 100毫升 总酸 以乳酸计克 100毫升 挥发酸 以乳酸计克 100毫升 4 讨论本方法也适用于葡萄酒 黄酒 酒精 食醋以及发酵醪中总酸 挥发酸 非挥发酸的测定 二 啤酒总酸度的测定啤酒中含有多种有机酸和无机酸 所谓啤酒的总酸度是指啤酒中各种酸的总和 它是以标准碱 1N氢氧化钠 中和一定量 100毫升 啤酒中的全部酸所消耗的体积表示 啤酒中的酸类有少部分来源于原料大麦 称为原始酸度 大部分酸来源于浸麦 发芽 糖化到发酵等各工艺过程中醇和酵母的作用 称为酵解酸度 啤酒总酸度测定是采用目视比色法 1 原理目视比色测定啤酒总酸度的方法 是用已知浓度的标准碱溶液 直接滴定试液 中和其中全部酸类 以乙酸为例其反应式 CH3COOH NaOH CH3COONa H2O 滴定终点的观察采用以pH9 0酚酞标准液的颜色与啤酒本身的颜色会在一起的综合颜色为标准颜色 将试液以标准碱滴到和这个标准颜色相同为止 2 试剂1 不含二氧化碳的蒸馏水 试剂1 39 2 中性乙醇 试剂1 40 3 50 中性乙醇水溶液4 0 05 酚酞溶液 试剂1 41 5 硼酸缓冲溶液 试剂1 42 6 0 1N氢氧化钠溶液 试剂1 43 4 计算按部颁标准规定 总酸度是以100毫升啤酒所耗1N氢氧化钠溶液的毫升数表示 即100毫升啤酒消耗氢氧化钠溶液的毫克当量数 式中N V 氢氧化钠溶液的当量浓度与消耗体积 毫升 100 40 将40毫升酒样换算成100毫升酒样中的酸度 5 讨论1 这个沿用了数十年的比色法之所以采用这种独特的判断终点的方法是因为 第一 啤酒中含许多种缓冲物质 如磷酸盐 氨基酸等 由于它们的缓冲作用 滴定中试液PH值变化缓慢 至使指示剂无明显的颜色突变 第二 啤酒中多种有机酸 无机酸共存 每种酸的等当点不一致 从理论上说 滴定中存在着多条滴定曲线 它们交织重叠 无法以指示剂颜色突变来判断终点 第三 本法是用标准碱来直接滴定带颜色的啤酒试样 滴定中颜色变化是在啤酒本身颜色基础上进行的 要使两侧比色条件一致 在pH9 0酚酞标准液一侧 须衬上啤酒本色 2 电位滴定法测定总酸与目视比色法相比 有操作简便 时间较短 结果准确 宜于众多试样的连续测定等优点 如能采用自动电位滴定计 以上优点则更为突出 三 电位滴定法测定啤酒的总酸度电位滴定法测定啤酒的总酸度与目视比色法相比 有操作简便 结果准确等优点 所使用的仪器为自动电位滴定计 也可使用普通的酸度计 1 试剂0 1N氢氧化钠溶液 试剂1 30 2 测定步骤准确吸取50毫升除气啤酒于小烧坏中 放入一搅拌棒 置于磁力搅拌器上 将玻璃电极和甘汞电极插入滴定液中 开动搅拌器 按下酸度计读数开关 以0 1N氢氧化钠溶液滴定酒样 随时观察溶液pH位变化 到接近pH9 0时应每加半滴停一停 直至酸度计指针恰好到pH9 0时即为终点 3 计算 式中N V 氢氧化钠溶液的当量浓度与消耗体积 毫升 100 50 将50毫升酒样换算成100毫升酒样中的浓度 五 白酒中总酯的测定酯为有机酸与醇类在酸性条件下经酯化作用而成 酒中香味在很大程度上与酯类的组成及含量有关 它是酒的一个很重要的质量指标 白酒中酯类成分极为复杂 其中有乙酸乙酸 已酸乙酯 丁酸乙酯 乳酸乙酯等 用化学分析法测得的为总酯 常以乙酸乙醋计算 原理白酒中总酯的测定是先用碱中和游离酸 再加入一定量的碱使酯皂化 过量的碱用酸滴定 二 试剂1 0 1N氢氧化钠溶液 试剂1 30 2 0 1N盐酸溶液 试剂1 46 3 0 5 酚酞指示剂 试剂1 38 三 测定步骤吸取50毫升酒样 置入500毫升三角瓶中 加2滴0 5 酚酞指示剂 用0 1N氢氧化钠溶液滴定至微红色 不可过量 再准确加入25毫升0 1N氢氧化钠溶液 按上回流冷凝器 于沸水浴中回流皂化半小时 取了冷却 立即用0 1N盐酸溶液滴定至红色刚刚消失 四 计算 式中N1 氢氧化钠溶液的当量浓度N2 V2 盐酸溶液的当量浓度与消耗体积 毫升 0 08812 乙酸乙酯的毫克当量 克 五 讨论1 总酯量大于0 4 时 皂化用0 1N氢氧化钠溶液改为30毫升 2 采用静置过夜进行皂化 其结果比沸水浴回流皂化半小时稍低 六 白酒中总醛的测定白酒中醛类有甲醛 乙醛 丙醛 丁醛 糖醛等 它是发酵过程中醇的氧化产物 醛类毒性较大 但适量的醛类对酒的香味却起着一定的作用 甲醛 乙醛沸点比乙醇低 故去除酒头能除去大部分醛类 白酒中总醛以乙醛计算 原理 二 试剂1 0 05N硫代硫酸钠溶液 参考试剂1 14 2 0 05N亚硫酸氢钠溶液 试剂1 47 3 0 05N碘溶液 参考试剂1 23 4 0 5 淀粉指示剂 试剂1 16 三 测定步骤吸取50毫升酒样 置入250毫升碘量瓶中 准确加入20毫升0 05N亚硫酸氢钠溶液 于暗处反应半小时 并经常摇动 准确加入25毫升0 05N碘溶液 摇匀 立即用0 05N硫代硫酸钠溶液滴定至浅黄色 加约1毫升0 5 淀粉指示剂 继续滴定至蓝色消失 同时作一空白试验 不加酒样 其余操作同上 四 计算 式中V 酒样测定时消耗硫代硫酸钠溶液体积 毫升 V0 空白试验时消耗硫代硫酸钠溶液体积 毫升 N 硫代硫酸钠溶液的当量浓度0 02203 乙醛的毫克当量 克 五 讨论1 试剂亚硫酸氢钠极易分解 故用后必须密闭防潮 所配的亚硫酸氢纳溶液2 3天后就会变质 故应新鲜配制 配制后最好用0 05N碘溶液粗略标定 然后调整至所需浓度 2 由于亚硫酸氢钠的不稳定性 最好采用焦性亚硫酸钠 又称偏重亚硫酸钠Na2S2O5 其作用与亚硫酸氢钠相同 Na2S2O5 H2O 2NaHSO3 七 原料中粗脂肪的测定脂肪也可作为微生物发酵中碳源之一 但在某些发酵生产中 脂肪含量过高却能影响发酵的进行或产生许多副产物 脂肪不溶于水 易溶于乙酸 石油醚 氯仿等有机溶剂中 脂肪的测定是用有机溶剂溶出 蒸发有机溶剂 残渣即为脂肪 然而残渣中除脂肪外 还包括其他挥发油 树脂 部分有机酸 色素等 故称为粗脂肪 原料中粗脂肪的测定 采用索氏抽提法 Soxblet 计算 讨论 乙酸易燃 在抽提 蒸发或蒸馏回收时 切忌明火加热 试样必须充分磨碎和烘干 颗粒太大及水分未烘干时 溶剂不易穿透 乙醚应是无水乙醚 否则能将试样中糖及无机物抽出 造成误差 乙酸可用无水硫酸钠或无水石膏 50克 升 振荡 静置过夜 蒸馏 八 原料中磷的测定磷是原生质和细胞核的组成分 许多辅酶和辅基中含有磷 磷在糖代谢中起着重要作用 同样对含氮物质的代谢也有影响 磷的测定方法很多 有重量法 容量法和比色法 磷与钼酸铵 氯化镁作用 生成磷酸铵镁 经灼烧后生成焦磷酸镁 称重 即为重量法 若将磷酸铵镁沉淀过滤 用EDTA滴定过量的氯化镁 即为容量法 将磷与钼酸铵作用 生成磷钼酸铵 在酸性条件下 用维生素C还原 生成钼蓝 即为比色法 1 原理重量法测磷原理是将试样经硫酸 硝酸消化后 在酸性条件下与钼酸盐反应 生成磷钼酸铵沉淀 沉淀溶于氨水中 经酸中和 与氯化镁反应 生成磷酸铵镁沉淀 然后将磷酸铵镁灼烧为焦磷酸镁 称重 2 试剂1 斐林试剂 试剂1 17 2 0 1 标准葡萄糖溶液 试剂1 18 3 测定步骤1 斐林试剂的标定 吸取斐林试剂甲 乙液各5毫升 置入250毫升三角瓶中 加10毫升水 并从滴定管中预先加入约20毫升0 1 标准葡萄糖溶液 其量控制在后滴定时消耗0 1 标准葡萄糖溶液1毫升以内 摇匀 于电炉上加热至沸 立即以4 5秒钟1滴的速度继续用0 1 标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失 此滴定操作得在1分钟内完成 总耗糖量为V0毫升 2 定糖 预备试验 吸取斐林试剂甲 乙液各5毫升 置入250毫升三角瓶中 加入V1毫升试样稀释液 含葡萄糖量约为5 15毫克 及适量的0 1 标准葡萄糖溶液 摇匀 以下同标定时操作 总耗糖量为V0毫升 正式试验 吸取斐林试剂甲 乙液各5毫升 置入250毫升三角瓶中 加V1毫升试样稀释液和 V2 1 毫升0 1 标准葡萄糖溶液 补加 V0 10 V1 V2 毫升水 摇匀 以下同标定时操作 总耗糖量为V毫升 4 计算 式中V0 斐林试剂标定值 毫升 V 斐林试剂测定值 毫升 C 标准葡萄糖溶液浓度N 试样稀释倍数V1 所取试样稀释液体积 毫升 四 麦芽糖化力的测定在啤酒生产中 麦芽中淀粉浸出率的多少 主要取块干淀粉糖化酶活力的大小 酶活力越强 糖化中产生的可溶性糖越多 麦芽的糖化能力即越高 麦芽糖化酶活力是以100克无水麦芽在20 pH4 3 30分钟内所产生的麦芽糖克数来表示 它是麦芽质量的重要指标之一 良好的淡色麦芽糖化力为250 350 次品在150以下 1 原理麦芽糖化力的测定是采用碘量法 原理 淀粉经糖化酶水解为葡萄糖 葡萄糖的醛基被弱氧化剂次碘酸钠所氧化 2 试剂1 2 可溶性淀粉溶液 试剂1 21 2 乙酸 乙酸钠缓冲溶液 试剂1 25 3 1N氢氧化钠溶液 试剂1 26 4 1N硫酸溶液 试剂1 27 5 0 1N硫代硫酸钠溶液 试剂1 14 6 0 1N碘溶液 试剂1 23 3 测定步骤1 麦芽浸出液的制备 称取粉碎麦芽20