微生物常规鉴定技术.ppt

第二章微生物常规鉴定技术 食品微生物检验常用的仪器培养基和实验室基本操作技术生物安全实验室生化实验和血清学实验 生化实验和血清学实验 常见的生化反应原理及现象血清学试验原理 一 概述 一 什么是生化试验 指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物 代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别 属种的试验 二 检验细菌的生化试验范围 1 糖 醇 类代谢试验2 氨基酸和蛋白质代谢试验3 有机酸盐和铵盐的利用试验4 呼吸酶类试验5 毒性酶类试验 三 生化试验的方法 在培养物中加入某种底物与指示剂 经接种 培养后 观察培养基的PH值变化 在培养物中加入试剂 观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应 根据酶作用的反应特性 测定酶的存在 根据细菌对理化条件和药品的敏感性 观察细菌的生长情况 四 生化试验的注意事项 1 待检菌应是新鲜培养物 培养18 24h 2 待检菌应是纯种培养物 3 遵守观察反应的时间 观察结果的时间 多为24或48小时 4 应做必要的对照试验 5 提高阳性检出率 至少挑取2 3待检的疑似菌落分别进行试验 二 糖醇类代谢试验 一 糖醇类发酵试验 二 葡萄糖氧化发酵 O F 试验 三 V P试验 四 甲基红 MethylRed 试验MR 一 糖醇类发酵试验 1 原理 不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同 有的能分解多种糖醇 有的只能分解1 2种糖醇 有的分解糖醇能产酸产气 有的分解糖醇只产酸不产气 根据这些特点 可鉴别细菌 常用的糖醇 单糖 葡萄糖 甘露糖醇 木糖 半乳糖鼠李糖双糖 乳糖 蔗糖 麦芽糖 蕈糖三糖 棉子糖多糖 菊糖 肝糖 淀粉醇类 甘露醇 山梨醇 肌醇 卫茅醇 2 试验方法 用接种针或环移取纯培养物少许 接种于糖发酵管中 若为半固体培养基 则用接种针作穿刺接种 置36 1 0 培养1 3天 每天观察结果 3 结果观察和记录 记录 产酸不产气 阳性 以 表示产酸产气 阳性 以 表示不产酸产气 阴性 以 表示 气泡 导管 气泡 气泡 阳性 阳性 阴性 培养基变为黄色 培养基未变色 无气泡产生 二 葡萄糖氧化发酵 O F 试验 1 原理 细菌对葡萄糖的分解 分为氧化型和发酵型 氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖 无氧的条件下不能分解葡萄糖 发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖 不分解葡萄糖的细菌称为产碱型 根据糖管的色泽变化可鉴别细菌 2 方法 取待检菌 以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上 在其中一管加入一层 约1Cm 灭菌的液体石蜡以隔绝空气 在37 培养2 4h天 每天观察结果 3 结果观察与记录 三 V P试验 1 原理 某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸 丙酮酸经缩合 脱羧生成乙酰甲基甲醇 后者在强碱环境下 被空气中的氧氧化为双乙酰 在 萘酚和肌酸的催化作用下 双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物 称V P 反应 2 试验方法 1 奥梅拉 O Meara 法 2 贝立脱 Barritt 氏法 3 快速法 奥梅拉法 将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 于36 1 培养48h 每1ml培养液加奥梅拉O Meara试剂0 1ml 摇动试管1 2min 静置于37 恒温箱4h 或在48 50 水浴放置2h后判定结果 3 结果观察与记录 1 发酵管出现红色者 为阳性 记V P 2 发酵管为黄色或铜绿色者 为阴性 记V P 四 甲基红试验 MR 1 原理细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后 由于代谢的途径不同 有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸 琥珀酸 醋酸和甲酸等大量酸性产物 使培养基PH值下降至pH4 5以下 使甲基红指示剂变红色 为甲基红试验阳性 有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮 醇类中性产物 培养液pH 5 4 甲基红指示剂呈桔黄色 为甲基红试验阴性 2 试验方法 挑取新鲜的待试培养物少许 接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 于36 1 或30 以30 较好 培养3 5天 从第48h起 每日取培养液1ml 加入甲基红指示剂1 2滴 立即观察结果 MR VP试验原理及照片 V P 3 结果观察与记录 1 呈鲜红色或橘红色为阳性 呈淡红色为弱阳性 记MR 2 呈橘黄色或黄色为阴性 记MR 迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性 即可判定结果 MR MR 复习题 1 什么是生化试验 2 做生化试验要注意哪些事项 3 简述糖醇类发酵试验的原理 写出其试验方法和结果的记录5 简述甲基红试验 MR 的原理 写出其试验方法和结果的记录 一 靛基质 吲哚 试验 二 H2S试验 三 尿素酶试验 四 氨基酸脱羧酶试验 五 苯丙氨酸脱氨酶试验 六 明胶 Gelatin 液化试验 三 氨基酸和蛋白质代谢试验 一 靛基质试验 1 原理 某些细菌含有色氨酸酶 能分解蛋白胨中的色氨酸 生成靛基质 吲哚 吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合 可形成红色化合物 即玫瑰吲哚 以此鉴别细菌 2 试验方法 所用试剂 1 柯凡克 Kovacs 试剂 或 2 欧 波试剂 将待检菌小量接种于培养基中 于36 1 培养24 48h时后 加入柯凡克试剂数滴 轻摇试管 呈红色者为阳性 或沿试管壁缓慢加入欧 波试剂约0 5ml覆盖液面 两液接触处呈现玫瑰红色者 为阳性反应 无红色者为阴性反应 3 结果观察与记录 呈现玫瑰红色 为阳性反应 记 无红色者 为阴性反应 记 靛基质 二 硫化氢 H2S 试验 1 原理 某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物 产生硫化氢 硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS 以此鉴别细菌 2 试验方法 挑取待检菌 用穿刺接种法接种于三糖铁培养上 于36 1 培养24 48h 观察结果 3 结果观察与记录 培养基底部呈黑色 为阳性 记 培养基底部无黑色 为阴性 记 三 尿素酶试验 1 原理 某些细菌能产生尿素酶 将尿素分解产生氨 氨使培养基变为碱性 使培养基中的酚红指示剂呈粉红色 培养基由黄色变为红色 为阳性 以此鉴别细菌 2 试验方法 挑取大量培养18 24h的待试菌 浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上 不要到达底部 留底部作变色对照 培养2 4和24h分别观察一次结果 培养基变为粉红色为阳性 颜色不变者为阴性 如阴性应继续培养至4天 作最终判定 3 结果观察与记录 培养基变呈粉红色 为阳性 记 培养基颜色不变 为阴性 记 阳性 四 氨基酸脱羧酶试验 1 原理 某些细菌能产生氨基酸脱羧酶 可使赖氨酸 鸟氨酸生产脱羧作用 生成胺类物质和CO2 胺类物质使培养基呈碱性变紫色 为阳性 如呈黄色为阴性 以此鉴别细菌 2 试验方法 取待检菌 分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内 在36 1 培养1 4天 指示剂为溴甲酚紫 每天观察结果 3 结果观察与记录 试验管呈紫色 对照管呈黄色 为阳性 记 试验管 对照管都呈黄色 为阴性 记 试验管 对照管 阳性 阴性 对照管变黄 试验管变黄 阳性反应试验管颜色变化过程 紫色 黄色 紫色原理 对照管呈黄色 说明有细菌生长 在培养的早期 10 12h 细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降 指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色 以后由于氨基酸脱羧生成胺 PH又回升至碱性 指示剂显紫色 阳性反应试验管颜色变化过程 紫色 黄色 紫色 五 苯丙氨酸脱氨酶试验 1 原理 某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶 使苯丙氨酸脱去氨基 形成苯丙酮酸 苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物 以此鉴别细菌 2 试验方法 从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物 接种于苯丙氨酸培养基上 在36 1 培养18 24h后 加入氯化铁溶液4 5滴 转动试管 使试剂与菌苔表面充分接触 立即观察结果 3 结果观察与记录 试验管立即出现绿色 为阳性 记 无色为阴性 记 加氯化铁试剂 出现绿色 六 明胶液化试验 1 原理有些细菌具有明胶酶 亦称类蛋白水解酶 能将明胶先水解为多肽 又进一步将多肽水解为氨基酸 明胶失去凝胶性质 使培养基由固态变为液态 2 试验方法 挑取培养18 24h的待试菌 以较大量穿刺接种于明胶高层约2 3深度 于20 22 培养7 14天 明胶高层亦可培养于36 1 另取一支未接种的培养基一同培养作对照 每天取出两支试管 放入冰箱放置20 30min后 再观察结果 3 结果观察与记录 明胶液化 为阳性 明胶凝固 为阴性 复习题 1 简述靛基质试验的原理 写出其试验方法 结果的记录和注意事项2 简述硫化氢试验的原理 写出其试验结果的记录和注意事项3 简述尿素酶试验的原理 写出其试验方法 结果的记录4 简述氨基酸脱羧酶试验的原理 写出结果的记录 阳性反应试验管颜色变化过程和原理 四 有机酸盐和铵盐的利用试验 枸橼酸盐利用试验丙二酸盐利用试验 一 枸橼酸盐利用试验 1 原理 某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源 分解枸橼 柠檬 酸盐生成碳酸盐 同时分解培养基的铵盐生成氨 使培养基变为碱性 使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色 为阳性 2 试验方法 挑取待检菌 在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种 在36 1 培养1 4天 每天观察结果 3 结果观察与记录 斜面有菌苔生长 培养基斜面变为蓝色或深蓝色 为阳性 记 无菌苔生长 培养基斜面仍为绿色者 为阴性 记 阳性 二 丙二酸盐利用试验 1 原理 某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源 丙二酸盐被分解成碳酸钠 使培养基变为碱性 培养基由草绿色变成蓝色 为阳性 以此鉴别细菌 2 试验方法 取待检菌新鲜纯培养物 接种于丙二酸钠培养基上 于36 1 培养48h 观察结果 3 结果观察与记录 培养基由草绿色变成蓝色 为阳性 记 培养基无颜色变化 为阴性 记 五 呼吸酶类试验 过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验氰化钾试验 一 过氧化氢酶试验 1 原理 某些细菌可分泌过氧化氢酶 加入过氧化氢后 可将过氧化氢分解生成水和氧气 产生气泡 即为阳性反应 2 试验方法 挑取固体培养基上的新鲜菌落一环 置于洁净玻片上 或试管 滴加3 过氧化氢液数滴 或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液 立即观察结果 3 结果观察与记录 产生气泡者 为阳性 记 不产生气泡者 为阴性 记 二 硝酸盐还原试验 1 原理 某些细菌具有还原硝酸盐的能力 可将硝酸盐还原为亚硝酸盐 在酸性条件下 亚硝酸盐可生成亚硝酸 亚硝酸与对氨基苯磺酸作用 生成重氮苯磺酸 重氮苯磺酸再与 萘胺作用 生成红色的化合物 呈红色反应 为阳性反应 试剂 A 对氨基苯磺酸试剂B 萘胺试剂 2 试验方法 取待检菌新鲜纯培养物 在硝酸盐培养基上接种 在36 1 培养1 4天 每天取2mL培养液 加入A B试剂的等量混合物各二滴混匀 立即观察结果 3 结果观察与记录 呈现红色 为阳性 记 若无红色出现 为阴性 记 四 氰化钾试验 1 原理 氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂 可与呼吸酶作用使酶失去活性 抑制细菌的生长 但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长 以此鉴别细菌 2 试验方法 取培养20 24h的营养肉汤培养液或菌落1环 接种至对照培养基及氰化钾培养基内 立即以橡胶塞塞紧 36 1 培养24 48h 观察结果 3 结果观察与记录 对照管有菌生长 试验管有菌生长为阳性 记 对照管有菌生长 试验管无菌生长为阴性 记 六 毒性酶类试验 溶血试验卵磷脂酶试验血浆凝固酶试验 一 溶血试验 1 原理 某些细菌在代谢过程中能产生溶血素 可使人或动物的红细胞发生溶解 不同的细菌有不同的溶血反应 借此可鉴别细菌 2 试验方法 有二种 平板法试管法 平板法 将培养物接种于血平板培养基上 36 1 培养24 48h 观察结果 溶血试验的溶血类型及现象 1 甲型 溶血 菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环 2 乙型 溶血 菌落周围出现较宽的透明溶血环 3 丙型 溶血 菌落周围无溶血环 甲型 溶血 乙型 溶血 丙型 溶血 二 血浆凝固酶试验 1 原理 致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶 可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白 附着在细菌的表面 形成凝块 或作用于血浆凝固酶原 使它成为血浆凝固酶 从而使抗凝的血浆发生凝固现象 为阳性 2 试验方法 1 玻片法 取清洁干燥载玻片 一端滴加一滴生理盐水 另一端滴加一滴兔 人 血浆 挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合 5min内 如血浆内出现团块或颗粒状凝块 而盐水滴仍呈均匀混浊 则为阳性 如两者呈均匀混浊 无凝则为阴性 有凝块 均匀混浊 血浆 生理盐水 血浆凝固酶试验 2 试管法 取灭菌小试管3支 各加入血浆0 5ml 1支加入被检菌株的营养肉汤培养液 或浓菌悬液 0 5ml 其余2支作对照管 1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0 5ml作阳性对照 另1支加入营养肉汤或0 9 氯化钠溶0 5ml作空白对照 将3管同时放37 温箱或水浴中培养 每0 5h观察一次 4h内无凝固现象者 观察直至24小时 阳性反应 阴性反应 不凝固 少量 零散凝固 明显的块状凝固 巨大块凝固 完全凝固 倒置不流动 3 试管法的结果观察与记录 空白对照管的血浆流动自如 阳性对照管血浆凝固 试验管血浆凝固者为阳性 均无凝固则为阴性 七 三糖铁 TSI 试验 1 三糖铁试验的原理 如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气 培养基全部变黄 如果只可以利用葡萄糖 葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄 但因量少 生成的少量酸 因接触空气而氧化 加之细菌利用培养基中含氮物质 生成碱性产物 故使斜面最后为红色 底部由于是在厌氧状态下 酸类不被氧化 仍保持黄色 如果细菌又能分解含硫化合物 产生硫化氢 培养基底部变黑 2 试验方法 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物 穿刺接种并涂布于斜面 置36 1 培养18 24h 观察结果 制好的培养基 对照管 斜面红色 底面黄色 培养基全黄色 斜面 底部黄色 并产生H2S 斜面红色 底部黄色 产生H2S 底面黄色 并产生CO2 思考题 提问 志贺氏菌都能分解葡萄糖 产酸不产气 大多不发酵乳糖 不产生H2S 在培养基上应该产生什么现象 大肠杆菌 能分解葡萄糖产酸产气 大多数能分解乳糖 不产生H2S 在培养基上应该是什么现象 沙门氏菌 能分解葡萄糖 不发酵乳糖 大多数产生H2S 多数产气 在培养基上应该是什么