小鼠子宫内膜的组织培养.doc

小鼠子宫内膜的组织培养【关键词】 子宫内膜In vitro culture of mouse endometriumTAN DongMei1, TAN Yi1, ZHAO Jie2, AI Ling2, WANG ZhiBiao21Laboratory Animal Center, 2Ultrasound Engineering Institute of Medical Science, Chongqing University of Medical Science, Chongqing 400016, China【Abstract】 AIM: To develop an in vitro culture model of mouse endometrium. METHODS: Mouse endometrium squeezed from the uterus horns were cultured at the gasliquid interface between F12/DMEM (11) including 200 mL/L FBS, 17.5 nmol/L insulin, 63.5 nmol/L progesterone, 7.14 nmol/L estradiol, and 50 mL/L CO2 plus 950 mL/L air. The effects of 20 g/L epidermal growth factor (EGF) and those of mixed gas containing 50 mL/L CO2 plus 950 mL/L O2 on the maintenance of the cultured endometrium were compared. The necrosis rate of the samples was measured after hematoxylineosin staining by using the image analysis system. The expressions of leukemia inhibitory factor (LIF) and heparinbinding epidermal growth factorlike growth factor (HBEGF) in the mouse endometrium were detected by immunohistochemistry to determine whether the endometrium cultured for 24 h was still receptive to the blastocysts. RESULTS: The necrosis rate (%) of the endometrium in the three groups was 19.403.38, 16.413.40 and 13.712.89 respectively, showing a significant difference (P=0.000). The positively rates of LIF and HBEGF proteins in both cultured and controlled mouse endometrium were 100% unexceptionally and there was no significant difference in the staining intensity for each marker before and after the culture (P=0.237, 0.224). CONCLUSION: The culture condition: F12/DMEM (11), 200 mL/L FBS, 17.5 nmol/L insulin, 63.5 nmol/L progesterone, 7.14 nmol/L estradiol, 20 g/L EGF and 50 mL/L CO2 plus 950 mL/L O2, proves to be most optimal for the growth of mouse endometrium in vitro. The endometrium cultured for 24 hours is still receptive to the blastocysts.【Keywords】 endometrium; culture; leukemia inhibitory factor; heparinbinding epidermal growth factorlike growth factor【摘要】 目的：建立小鼠子宫内膜的体外培养方法. 方法：用挤压法获得子宫内膜，在添加200 mL/L胎牛血清(FBS)，17.5 nmol/L胰岛素，63.5 nmol/L孕酮(P4)，7.14 nmol/L雌二醇(E2)的F12/DMEM(11)培养液和50 mL/L CO2 + 950 mL/L空气界面进行培养，比较分析20 g/L表皮生长因子(EGF)和50 mL/L CO2 + 950 mL/L O2气体条件对子宫内膜维持的影响. HE染色，图像分析系统检测样本坏死率，并用SP法检测培养前后子宫内膜中白血病抑制因子(LIF)及类肝素结合样表皮生长因子(HBEGF)的表达. 结果：三组子宫内膜的坏死率()分别为19.403.38，16.413.40和13.712.89，其差异有显著性(P=0.000)；LIF及HBEGF在培养前后小鼠子宫内膜的阳性表达率均为100，且同一指标在培养前后子宫内膜的阳性强弱分布无显著性差异(P分别为0.237，0.224).结论：添加200 mL/L FBS, 63.5 nmol/L P4, 7.14 nmol/L E2, 17.5 nmol/L胰岛素和20 g/L EGF的F12/DMEM(11)培养液和50 mL/L CO2 +950 mL/L O2的气体环境最有利于小鼠子宫内膜的体外培养；子宫内膜在上述条件下培养24 h后，对囊胚仍具有容受性. 【关键词】 子宫内膜；培养；白血病抑制因子；类肝素结合样表皮生长因子0引言迄今为止，用于胚胎体外着床模型的母体成分有子宫内膜上皮细胞、基质细胞、细胞外基质、人工合成的子宫内膜样组织、子宫或子宫内膜及人胎盘羊膜等，其中以子宫内膜上皮细胞应用最多. 这种模型母体成分单一，不能代表子宫内膜结构的立体性和细胞成分的多样性，只能实现胚胎成分在母体成分的贴附与外延生长，没有滋养细胞的侵入行为，不能全面反映在体的着床过程. 本研究拟获取结构完整的小鼠子宫内膜作为母体成分进行体外培养，建立小鼠子宫内膜的组织培养方法，为下一步研究胚胎的体外着床奠定基础.1材料和方法1.1材料清洁级昆明小鼠，68 wk，体质量2030 g，由重庆医科大学实验动物中心提供. 雌雄按21自然合笼，次晨发现阴栓者记为妊娠1 d. 用不锈钢组织滤网制作高约0.2 cm的支架，上铺一张擦镜纸备用. 解剖镜、IX70型倒置显微镜及BX40光学显微镜（Olympus）、TC2323型CO2孵箱（ShelLab）、CM2000B生物医学图像分析系统（北航）、自制培养箱（本校医学超声工程研究所工程部）. DMEM, HamsF12培养基及FBS（Gibco）；E2及P4(Sigma)；胰岛素(Boehringer Mannheim)；rhEGF(Promega). LIF多克隆兔抗（北京中山），HBEGF多克隆羊抗（Santa Cruz）；SP免疫组化试剂盒及液体DAB酶底物显色试剂盒（北京中山）. 实验用混合气体由重庆泰和气体厂生产.1.2方法1.2.1子宫内膜的获取和处理脱颈处死妊娠4.5 d小鼠，剖腹剪取双侧子宫角，用F12/DMEM(11)培养基冲洗宫腔，选择冲出发育良好囊胚的子宫角用挤压法1获得条状子宫内膜，剪去其两端，将余下的子宫内膜剪成2.0 mm左右的小段，随机选择几段作为对照，其余则用于培养.1.2.2培养条件第1组：F12/DMEM(11)+200 mL/L FBS，添加17.5 nmol/L胰岛素，63.5 nmol/L P4，7.14 nmol/L E2；37，50 mL/L CO2 + 950 mL/L空气，饱和湿度. 第2组：F12/DMEM(11)+200 mL/L FBS，添加17.5 nmol/L胰岛素，63.5 nmol/L P4，7.14 nmol/L E2，20 g/L EGF；37，50 mL/L CO2 + 950 mL/L空气，饱和湿度. 第3组：F12/DMEM(11)+200 mL/L FBS，添加17.5 nmol/L胰岛素，63.5 nmol/L P4，7.14 nmol/L E2，20 g/L EGF；37，50 mL/L CO2 + 950 mL/L O2，饱和湿度.1.2.3液气界面培养将支架置于24或12孔培养板中，滴加培养液至恰好将擦镜纸浸湿，在解剖镜下将子宫内膜从缺口处展开，上皮面朝上放在支架上，第1, 2组置于CO2孵箱中培养；第3组置于CO2孵箱内部的自制培养箱中培养，箱内预先注入一定量的无菌三蒸水，以保持培养箱内饱和湿度，用凡士林封闭箱门，从培养箱顶端的入气口缓慢通入混合气体，调整入气量至位于水面下0.5 cm的出气管口约每秒钟有一个气泡冒出为止，持续通气.1.2.4光镜观察取培养24 h的子宫内膜，固定于40 g/L甲醛液中，石蜡包埋切片，HE染色. 通过图像分析系统测得每个样本的坏死率（样本坏死组织的总面积值/样本组织的总面积值），计算每组的平均坏死率，确立子宫内膜的培养条件.1.2.5免疫组织化学将培养24 h的子宫内膜固定于40 g/L甲醛液中，石蜡包埋，制备5 m的连续切片，用未经培养的子宫内膜作对照. 用SP法检测两组LIF及HBEGF的表达情况. 两种一抗的工作浓度均为1100.阳性和阴性判断标准：根据细胞染色强度和阳性细胞所占比例进行半定量测定. 染色强度评分标准为未染色0分，黄色1分，棕黄色2分，黄褐色3分. 阳性细胞所占比例评分标准为无阳性细胞记0分，50阳性细胞记3分. 两种评分相加01分为阴性，2分为可疑阳性，3分为弱阳性，45分为中度阳性，6分为强阳性. 统计学处理：计量资料和等级资料的组间差异性比较分别采用单因素方差分析和秩和检验（MannWhitney 法），数据由SPSS 11.0统计软件包处理完成，P0.05时认为其差异有显著性.2结果2.1对照组子宫内膜的显微结构腔上皮细胞极性明显，呈柱状，细胞核长椭圆形，位于基底面. 内膜腺体发达，腺上皮细胞柱状或方形，腔内有分泌物. 毛细血管较丰富，管壁完整，可见血管内皮细胞及血管腔中的红细胞团（Fig 1A）.图1小鼠子宫内膜，示腺体、间质细胞(略)2.2实验组（第13组）子宫内膜的显微结构培养24 h后，腔上皮细胞呈柱状或方形，极性仍存在，间质中细胞间隙加大，更加疏松，腺体和毛细血管结构完整，分别可见腔内的分泌物和红细胞. 但是，部分上皮细胞出现不同程度的核固缩、核淡染，基质中还散在有坏死崩解的细胞碎片（Fig 1B）.2.3不同培养条件下小鼠子宫内膜的坏死情况见Tab 1.表1不同培养条件下的子宫内膜坏死率(略)图2小鼠子宫内膜LIF染色阳性(略)2.4免疫组化结果LIF及HBEGF在对照组和实验组小鼠子宫内膜均有表达，其阳性产物均主要定位于子宫内膜腔上皮和腺上皮细胞的胞质和胞膜上，呈棕黄色均匀分布（Fig 2A, B；3A,B）；子宫内膜的间质细胞也有少量的LIF及HBEGF表达(Tab 2).图3小鼠子宫内膜HBEGF染色阳性(略)表2LIF和HBEGF在小鼠子宫内膜的表达情况(略)3讨论围着床期小鼠子宫内膜的生长发育受生殖激素、生长因子、细胞因子及蛋白等的调控，且这些因素间错综复杂的相互调节使子宫内膜进行有序的增殖和分化，从而建立内膜的容受态. 因此，要建立一套成熟的子宫内膜体外培养方法相当困难. 本研究在胚胎培养技术的基础上，从培养液的组分、培养的物理条件和培养方式三方面加以了改进.用于胚胎培养的培养液多种多样，包括HamsF12, HamsF10, DMEM及RPMI 1640等，为了改善胚胎的生长，有的还添加谷氨酰胺、乳酸钠、牛血清白蛋白、小牛或胎牛血清等. Shiotani等2采用F12/DMEM(11)+100 mL/L胎牛血清的培养液来培养子宫内膜，培养观察的时间只有60 min. Landgren等3则选择RPMI 1640加上患者的自身血清. 在预实验的基础上，本研究选择F12/DMEM (11)+200 mL/L胎牛血清. 由于雌激素和孕激素对围着床期小鼠子宫内膜的增殖或(和)分化及胚胎着床是必需的，通过预实验比较，确定补充63.5 nmol/L P4,7.14 nmol/L E2. 由于胰岛素有促进上皮细胞生长的作用，故又补充了17.5 nmol/L胰岛素. EGF是一种强的有丝分裂原，子宫内膜腺上皮和基质细胞均有其受体表达. 体外实验表明，5及10 g/L的rhEGF明显刺激子宫内膜上皮细胞和基质细胞的增殖4. 因此通过比较，我们在培养液中添加了20 g/L EGF，子宫内膜经上述培养液培养24 h后，内膜的坏死率与未加EGF组比较有显著性差异；此外，在培养液中添加EGF还有利于囊胚与子宫内膜共培养时囊胚着床的启动. 通过实验比较，我们认为F12/DMEM(11)+200 mL/L FBS，添加17.5 nmol/L胰岛素，63.5 nmol/L P4，7.14 nmol/L E2，20 g/L EGF的培养液和50 mL/L CO2+950 mL/L O2的培养条件更适合小鼠子宫内膜的体外生长，培养24 h后的组织切片表明，子宫内膜维持了细胞成分的多样性和结构的立体性，子宫内膜腺体结构完好，但部分上皮细胞和基质细胞坏死. 其原因可能有：围着床期的子宫内膜生长发育的调控因素复杂，目前我们所用的子宫内膜培养条件尚不能完全满足其体外生长的要求. 培养液中添加的激素、EGF是否发挥了最大效应. 生理状态下，围着床期的雌孕激素及EGF的浓度均呈动态变化，且还有前列腺素、催乳素等激素和其他因子如LIF, IL1参与子宫内膜发育的调节.正常子宫内膜对胚胎着床的敏感性可分为接受前期、接受期和非接受期5. 子宫内膜只有在接受期或着床窗才能接受胚胎植入. 着床窗期子宫内膜呈现时空特异性的形态学改变和特异的蛋白分子表达，它们可作为子宫内膜容受性的标记分子. LIF及HBEGF为介导胚泡着床的2种必需细胞因子. LIF mRNA和蛋白在哺乳动物着床期呈短暂性、峰性表达，着床前后的表达量明显降低 6,7. HBEGF在小鼠胚泡着床前子宫内膜的表达呈区域性和暂时性升高；在人类植入窗口期的子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞表达最强，提示HBEGF在胚泡植入过程中介导胚胎着床8,9. 本研究发现，小鼠子宫内膜经体外培养24 h后，LIF及HBEGF的表达与培养前无明显差异，这提示体外培养24 h后的子宫内膜对囊胚仍具有容受性.【参考文献】1 谭毅,顾美礼,王智彪. 完整分离围着床期小鼠子宫内膜方法的建立J. 中国实验动物学报，2001;9（1）：40-44.Tan Y, Gu ML, Wang ZB. Study on isolating the complete endometrium from the uterus of periimplantation mouse J. Acta Lab Animalis Scientia Sinica, 2001; 9(1): 40-44.2 Shiotani M, Nada Y, Mori T. Embryodependent induction of uterine receptivity assessed by an in vitro model of implantation in mice J. Biol Reprod, 1993; 49(4): 794-801.3 Landgren BM, Johannisson E, StavreusEvers A. A new method to study the process of implantation of a human blastocyst in vitro J. Fertil Steril, 1996; 65(5): 1067-1070.4 张丽凤, 苏应宽, 盖凌,等. 表皮生长因子对子宫内膜细胞体外增殖的影响J. 生殖医学杂志，1999;8（1）：28-32.Zhang LF, Su YK, Gai L, et al. The effect of epidermal growth factor on the proliferation of endometrial cells in vitroJ. J Reprod Med Sci, 1999;8（1）：28-32.5 Dey SK. ImplantationA. 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