梅毒实验室诊断技术

梅毒实验室诊断技术 黑河市疾病预防控制中心胡丽欣 概述 梅毒是由苍白螺旋体 TP 引起的一种慢性性传播疾病 本病临床表现复杂 可侵犯人体全身器官 既能产生各种各样的症状和体征 又可多年无症状而呈潜伏状态 梅毒主要通过性接触传播 也可以通过胎盘传播而发生胎传梅毒 梅毒的实验室诊断方法主要有病原学检查法和血清学检测法 梅毒实验室诊断 病原学检测方法 血清学检测方法 其他检测方法 暗视野显微镜检查 镀银染色检查 非梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒IgM抗体的检测 胎传梅毒的实验诊断 神经梅毒的实验室诊断 梅毒实验室诊断 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 基本原理 梅毒硬下疳 扁平湿疣 黏膜斑等皮损的渗出液涂片 以及淋巴结穿刺液涂片等 在暗视野显微镜下 光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光 从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 仪器材料 暗视野显微镜 钝刀 刮勺 载玻片盖玻片 注射器具 无菌生理盐水 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 标本采集 皮肤黏膜组织液 无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物 钝刀轻刮 挤压皮损表层 取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片镜检 淋巴液 无菌操作下穿刺淋巴结 注入生理盐水并反复抽吸2 3次 取少量的淋巴液直接滴于载玻片上 加盖玻片镜检 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 操作步骤 加镜油 在暗视野显微镜的聚光器上滴加镜油 聚光 将标本玻片置载物台上 上升聚光器使镜油接触载玻片底面 镜检 在镜下观察 寻找有特征形态和运动方式的梅毒螺旋体 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 结果判读 梅毒螺旋体在暗视野显微镜镜下表现为纤细 白色 有折光的螺旋状微生物 长5 20 m 直径小于0 2 m 有6 12个螺旋 具有旋转 蛇行及伸缩等三种特征性的运动方式 暗视野显微镜下发现有上述特征的螺旋体为阳性结果 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 结果报告 1 阳性 见到上述特征的梅毒螺旋体 2 阴性 未见到上述特征的梅毒螺旋体 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 临床意义 暗视野显微镜检查阳性 可确诊梅毒 螺旋体检查是诊断早期现症梅毒的最好方法 世界卫生组织指定为性病实验室必备项目之一 如未见到梅毒螺旋体 并不能排除患梅毒的可能性 应复查和血清学检查 病原学检测法 暗视野显微镜检查法 注意事项 取材时尽量避免出血 以免影响镜下观察 取材后应立即置暗视野显微镜下观察 镜下观察时应注意与其他螺旋体相鉴别 病原学检测法 镀银染色检查 基本原理 梅毒螺旋体具有亲银性 可被银溶液染色 从而可以在镜下观察到梅毒螺旋体 病原学检测法 镀银染色检查 仪器材料 1 显微镜 2 罗吉氏固定液 鞣酸媒染剂 Fontana氏银溶液 病原学检测法 镀银染色检查 标本采集 皮肤黏膜组织液 无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物 钝刀轻刮 挤压皮损表层 取渗出液涂片 淋巴液 无菌操作下穿刺淋巴结 注入生理盐水并反复抽吸2 3次 取少量的淋巴液直接滴于载玻片上 病原学检测法 镀银染色检查 操作步骤 涂片干燥 将标本涂于干净载玻片作一薄片 于空气中自然干燥 2 固定 用固定液将涂片固定2分钟 3分钟 3 洗涤 用无水乙醇洗涤玻片上的油污 4 媒染 加媒染剂于涂片上 微加热产生蒸汽 染30秒 5 银染 水洗 加银染液于涂片上 微加热产生蒸汽 染30秒 6 镜检 水洗 待干 用油镜检查 病原学检测法 镀银染色检查 结果判读 显微镜下见到染成棕褐色的梅毒螺旋体为阳性结果 结果报告 1 阳性 见到染成棕褐色梅毒螺旋体 2 阴性 未见到染成棕褐色的梅毒螺旋体 注意事项 应注意与其他螺旋体加以鉴别 病原学检测法 血清学检测法 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 基本原理 梅毒螺旋体感染人体后 宿主会产生抗类脂抗原的抗体 反应素 在心磷脂 卵磷脂和胆固醇等组成的抗原中加入活性炭颗粒 与待检血清 浆 中的反应素结合 形成肉眼可见的黑色絮状物 从而检测梅毒患者血中的抗类脂抗原的抗体 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 仪器材料 水平旋转仪 RPR试剂盒 RPR抗原 直径为18mm圆圈的反应卡片 抗原滴管 针头 标本采集 血清 抽取静脉血 室温静止凝固后 分离新鲜血清 也可采用冻存的血清 血浆 各种抗凝剂制备的血浆 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 操作步骤 1 定性试验 1 加样 吸取0 05mL血清 浆 放在卡片圈中 并均匀地涂布在整个圈内 2 加抗原 将抗原轻轻摇匀 用9号针头 每毫升 60 1 滴 加1滴抗原 3 反应 将卡片置水平旋转仪旋转8分钟 100 5 转 分钟 立即在亮光下观察结果 黑龙江省性病防治中心 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 定量试验 1 稀释液准备 在圈内加入0 05mL生理盐水 根据需要确定稀释度 勿将盐水涂开 2 加样 吸取0 05mL血清 浆 与各圈中盐水作系列稀释 并涂布整个圈内 3 加抗原反应同定性试验 2 3 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 结果判读 凝集反应强度分级 3 4 圆圈内出现中到大的黑色絮状物 液体清亮2 圆圈内出现小到中的黑色絮状物 液体较清亮1 圆圈内出现小的黑色絮状物 液体混浊 圆圈内仅见碳颗粒集于中央一点或均匀分散 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 结果报告 1 定性试验 1 阳性 出现1 4 强度的凝集反应 2 阴性 不产生凝集反应 2 定量试验 滴度 出现凝集反应的血清最高稀释倍数 血清学检测法 快速血浆反应素 RPR 环状卡片试验 临床意义 1 RPR试验适用于梅毒筛查 疗效观察 复发或再感染的检查 2 对未经治疗的一期 二期和潜伏梅毒患者的敏感性别为86 100 和98 可能有生物学假阳性 滴度常 1 8 急性发热性传染病 妊娠 吸毒 胶原性疾病 SLE 类风关 注意事项 试验应在23 29 环境中进行 血清学检测法 TRUST试验 TRUST试验是用甲苯胺红颗粒代替RPR试验中的碳颗粒作为指示物 所以阳性结果为红色絮状物 其基本原理 仪器材料 标本采集 操作步骤 结果判读 结果报告 临床意义及注意事项等与RPR试验基本相同 血清学检测法 非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点 前带现象指非梅毒螺旋体抗原血清试验中 有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性 不典型或阴性反应的结果 而临床上又象二期梅毒 此时将血清稀释后再进行试验 出现了阳性的结果 该现象称为前带现象 非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点 耐血清性 血清固定 指经抗梅毒治疗后 非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转 早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗 复发 再感染或有神经系统梅毒等因素有关 梅毒螺旋体抗原血清试验 梅毒螺旋体抗原血清试验是以梅毒螺旋体为抗原的特异性的抗原抗体反应 用以检测梅毒抗体 常用的方法有 梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验 TPPA 梅毒螺旋体血球凝集试验 TPHA 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验 TP ELISA 荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验 FTA ABS 梅毒螺旋体蛋白印迹试验 TP WB 等 血清学检测法 TPPA试验 基本原理 TPPA试验是用超声裂解梅毒螺旋体抗原 致敏明胶粒子 其致敏粒子与待检血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合 产生肉眼可见的凝集 仪器材料 1 微量震荡器2 试剂盒 A 溶解用液 B 标本稀释液 C 致敏粒子 D 未致敏粒子 E 质控血清 3 U型反应板 血清学检测法 TPPA试验 标本采集 同RPR试验操作步骤 1 试剂准备 试验前将待检样本和试剂应恢复到室温 2 加稀释液 每份样本做4孔 加B液至反应孔内 第1孔100 L 第2 4孔各25 L 3 样本稀释 取血清25 L加至第1孔 混匀后取25 L至第2孔 连续倍比稀释至第4孔 最后1孔混匀后弃去25 L 4 加对照液 第3孔加D液25 L 第4孔加C液25 L 5 混合 将反应板置震荡器震荡30秒 6 反应 置湿盒内 孵育2小时后 或放4 冰箱过夜观察结果 血清学检测法 TPPA试验 结果判读 观察凝集反应强度 分级如下 4 粒子光滑覆盖整个孔底 有时边缘有折叠3 粒子光滑覆盖大部分孔底2 粒子光滑聚集覆盖孔底 周围有一细胞环1 粒子光滑集聚覆盖孔底 周围有一明显细胞环 粒子沉集孔底 中央形成一小点 粒子紧密沉积孔底中央 血清学检测法 TPPA试验 结果报告 阳性 未致敏粒子不出现凝集 第3孔 血清1 80以上稀释与致敏粒子产生1 4 凝集反应 阴性 未致敏粒子和致敏粒子均不产生凝集反应 血清学检测法 TPPA试验 临床意义 TPPA可作为非梅毒螺旋体抗原血清试验 如RPR等 初筛阳性标本的确证试验 2 梅毒患者经过抗梅治疗后 TPPA试验仍可阳性 故TPPA试验阳性不能作为疗观察的指标 3 TPPA阳性不能区分既往感染和现症感染 应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验结果进行诊断 血清学检测法 TPPA试验 注意事项 试验结果为 可疑 时 应选用其他的试验方法进行复验 如未致敏粒子出现凝集反应 样本进行吸收后再进行试验 或改用其他试验方法 血清学检测法 TPHA试验 基本原理 TPHA试验用超声裂解的梅毒螺旋体菌体为抗原致敏经醛化 鞣化的羊或禽类红细胞 与抗梅毒螺旋体抗体反应 产生肉眼可见的抗原抗体凝集 血清学检测法 TPHA试验 仪器材料 微量震荡器TPHA试剂盒 A 溶解用液 B 标本稀释液 C 致敏粒子 D 未致敏粒子 E 质控血清U型反应板标本采集 同RPR试验 血清学检测法 TPHA试验 操作步骤 1 试剂准备 试验前试剂恢复到15 25 2 加稀释液 加B液至反应板 第1孔25 L 第2孔100 L 第3 5孔各加25 L 3 样本稀释 取血清25 L加至第1孔 混匀后取25 L至第2孔 混匀后取25 L至第3孔 混匀后弃去25 L 再从第2孔取25 L至第4孔 混匀后取25 L至第5孔 混匀后弃去25 L 4 加对照液 第3孔加D液 未致敏细胞 75 L 第4 5孔加C液 致敏细胞 各75 L 5 混合 将反应板置震荡器震荡30秒 6 反应 置湿盒内 15 25 孵育4小时 或放4 冰箱过夜观察结果 血清学检测法 TPHA试验 结果判读 同TPPA试验 结果报告 同TPPA试验 临床意义 同TPPA试验 注意事项 有些采用禽类红细胞为载体的TPHA试验 血清不用吸收 可直接进行试验 血清学检测法 TP ELISA试验 基本原理 TP ELISA试验是用包被在固相板条上经超声裂解 纯化处理或重组的梅毒螺旋体抗原 与待检血清中的梅毒特异性抗体结合 再与酶标记的抗人免疫球蛋白单克隆抗体反应 形成抗原抗体复合物而使底物显色 血清学检测法 TP ELISA试验 仪器材料 酶标仪 洗板机 试剂盒组成 96孔反应板 标本稀释液 洗涤液 酶结合物 底物液 终止液 阳性对照 阴性对照 标本采集 同RPR试验 血清学检测法 TP ELISA试验 操作步骤 1 加稀释液 取标本稀释液加到反应板孔内 2 孵育 分别加入阳性 阴性对照和待检血清 置37 孵育一定时间 洗板 3 加酶结合物 加酶结合物 置37 孵育一定时间 洗板 4 加显色剂 加底物 37 避光孵育 5 终止反应 加终止液 酶标仪测OD 光密度 值 血清学检测法 TP ELISA试验 结果判读 1 每次试验的阳性 阴性对照应在规定的数值范围内2 根据阳性 阴性OD值设定阈值 cutoff 结果报告 1 阳性 标本OD值大于或等于cutoff值 2 阴性 标本OD值小于cutoff值 血清学检测法 TP ELISA试验 临床意义 1 适用于流行病学调查或大样本量标本的检测 2 ELISA阳性不能区分既往感染和现症感染 应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验 如TRUST等 结果进行诊断 注意事项 1 不同批号试剂不能混用 2 温度和时间必须严格控制 血清学检测法 非梅毒螺旋体抗体试验结果解释示意图 早期 晚期 一期 二期 早期潜伏 晚期潜伏 三期 治疗前治疗后 阳性 阴性 血清学检测法 梅毒螺旋体抗体试验结果解释示意图 早期 一期 二期 早期潜伏 晚期 晚期潜伏 三期 治疗前治疗后 阳性 阴性 血清学检测法 梅毒血清学试验结果的临床意义总汇 TRUSTTPPA意义RPRTP ELISAVDRLTPHA 排除梅毒一期梅毒的早期 现症梅毒 梅毒孕妇所生的婴儿除外 生物学假阳性 早期梅毒经治疗后 血清学检测法 TP WB试验 用超声粉碎的梅毒螺旋体或梅毒螺旋体重组的不同抗原 印迹至硝酸纤维膜条上 通过酶联反应 可检测梅毒血清中多种特异抗原成分的抗体 可以用于检测IgM或IgG抗体 血清学检测法 快速免疫层析法 利用免疫层析原理 采用吸附有显色标记的梅毒螺旋体重组抗原的滤纸条 快速检测标本中的梅毒螺旋体抗体 可以用于标本的快速筛查 检测阳性不能区分既往感染和现症感染 应结合非梅毒螺旋体抗原血清试验 如TRUST等 结果进行诊断 血清学检测法 其他检测方法 梅毒IgM抗体的检测胎传梅毒的实验诊断神经梅毒的实验室诊断 梅毒IgM抗体的检测 与其它细菌及病毒感染一样 在梅毒中特异性IgM抗体的合成是第一次感染后的体液免疫应答 在梅毒中螺旋体IgM抗体出现在早期梅毒患者中 在潜伏期及晚期患者也能发现 在自发痊愈的患者中IgM水平下降的速度比治疗痊愈的患者慢 IgM分子大使其不能通过胎盘屏障及完整无损的血脑屏障 因此若在新生儿血中检测到IgM抗体是儿童产前感染的诊断标志 如在患者的 其他检测法 梅毒IgM抗体的检测 完整无损的血脑屏障的脑脊液 CSF 中出现 则表示患有活动性神经梅毒 在最近未接受治疗的患者血液中或CSF中出现抗梅毒IgM抗体均表示需要治疗 测定IgM抗体方法的基本原理是采用分离柱 使血清中的IgM和IgG按其分子量大小在分离过程中的沉降速度不同 将IgM和IgG分别收集 再进行FTA ABS等试验 亦可采用抗IgM单克隆抗体的酶标法 蛋白质印迹法等 血清学检测法 梅毒IgM抗体的检测 进行检测 目前测定IgM抗体的方法的敏感性还很不理想 但是检查到IgM抗体则有助于对以下病例中的试验结果更可靠的解释 先天性梅毒 早期一期梅毒 晚期梅毒 非梅毒螺旋体试验的血清阳转前的早期感染患者的判愈试验及有梅毒史或其它螺旋体感染史患者的再感染 血清学检测法 胎传梅毒的实验诊断 具有下列实验室四个指标之一 可确诊为胎传梅毒 暗视野检查梅毒螺旋体阳性 患儿非梅毒螺旋体血清抗体滴度持续上升 患儿非梅毒螺旋体血清学定量试验结果比母亲高4倍 低于或等于该值并不排除胎传梅毒 患儿检出19S IgM抗体 血清学检测法 神经梅毒的实验室诊断 1 神经梅毒的实验室诊断标准包括 梅毒血清学检查阳性 脑脊液细胞计数或蛋白测定结果异常 脑脊液VDRL试验阳性 2 脑脊液VDRL试验是神经梅毒的标准试验 阳性结果可诊断为神经梅毒 但该试验存在假阴性 3 脑脊液的FTA ABS试验阴性可排除神经梅毒 但特异性不高 可能产生假阳性 4 脑脊液检查内容 1 细胞计数 正常时白细胞数应小于3 106 L 若白细胞数大于10 106 L 提示中枢神经系统有炎症现象 2 蛋白质量测定 总蛋白质量正常为0 1 0 4g L 神经梅毒可稍升高 或高达1 0 2 0g L 血清学检测法 梅毒血清学检测中注意的问题 一 梅毒的临床诊断1 流行病学史 多性伴 不安全性行为 有梅毒感染史 输血史等 2 临床表现3 实验室检查 证据 梅毒血清学检测中注意的问题 二 用于监测疫情的检测策略要使用ELISA 特异性抗体 进行筛查 TPPA明胶凝集法 FTA ABS荧光 TPHA凝集法 结果阴性者判定阴性结果 结果为阳性者必须进入复检 复检时要用非特异性抗体诊断方法RPR 快速血浆反应环状卡片实验 TRUST 甲苯胺红不